Краткая история открытия и применения антител. Приобретенные (вторичные) иммунодефициты

Антитела - белки сыворотки крови и других биологических жидкостей, которые синтезируются в ответ на введение антигена и обладают способностью специфически взаимодействовать с антигеном, вызвавшим их образование, или с изолированной детерминантной группой этого антигена (гаптеном).

Защитная роль А. как факторов гуморального иммунитета обусловлена их антигенраспознающей и антигенсвязывающей активностью и рядом эффекторных функций: способностью активировать систему комплемента, взаимодействовать с различными клетками, усиливать фагоцитоз. Эффекторные функции А. реализуются, как правило, после их соединения с антигеном, вслед за которым происходит удаление чужеродного агента из организма. При инфекциях появление в крови больного А. против возбудителя инфекции свидетельствует о сопротивлении организма данной инфекции, а уровень антител служит мерой напряженности иммунитета.

Впервые появление в крови у животных веществ, которые специфически взаимодействовали с введенными ранее токсинами бактерий, обнаружили в 1890 г. Беринг и Китасато (Е. Behring, S. Kitasato). Вещество вызывало обезвреживание токсина и было названо антитоксином. Более общий термин «антитела» был предложен, когда выявили возникновение подобных веществ при введении в организм любых чужеродных агентов. Первоначально о появлении и накоплении А. судили по способности исследуемых сывороток давать при соединении с антигенами видимые серологические реакции или по их биологической активности - способности нейтрализовать токсин, вирус, лизировать бактерии и чужеродные клетки. Предполагали, что каждому феномену соответствуют особые А. Однако впоследствии оказалось, что тип антиген - антитело реакции определяется физическими свойствами антигена - его растворимостью, а антитела разной специфичности и видового происхождения принадлежат к гамма-глобулиновой фракции крови или, по номенклатуре ВОЗ, к иммуноглобулинам (lg). Иммуноглобулины - это совокупность сывороточных белков, несущих активность антител. Позже была обнаружена гетерогенность по физико-химическим свойствам и сродству к антигену антител одной специфичности, выделенных от одного индивида, и показано, что они синтезируются в организме разными клонами плазматических клеток. Важным шагом в изучении строения антител стало использование с этой целью миеломных белков - гомогенных иммуноглобулинов, синтезируемых одним клоном плазматических клеток, подвергшихся малигнизации.

Классы иммуноглобулинов и их физико-химические свойства. Иммуноглобулины составляют около 30% всех белков сыворотки крови. Их количество значительно возрастает после антигенной стимуляции. Антитела могут принадлежать к любому из пяти классов иммуноглобулинов (lgA, lgG, lgM, lgD, lgE). Молекулы иммуноглобулинов всех классов построены из ептидных цепей двух видов: легких (L) с молекулярной массой около 22000, одинаковых для всех классов иммуноглобулинов, и тяжелых (Н) с молекулярной массой от 50000 до 70000 в зависимости от класса иммуноглобулина. Структурные и биологические особенности каждого класса иммуноглобулинов обусловлены особенностями строения их тяжелых цепей. Основной структурной единицей иммуноглобулинов всех классов является димер двух идентичных пар легкой и тяжелой цепей (L-Н) 2 .

Иммуноглобулин G (lgG) имеет молекулярную массу около 160000, молекула состоит из одной (L-Н) 2 -субъединицы и содержит два антигенсвязывающих центра. Это основной класс антител, составляющий до 70-80% от всех иммуноглобулинов сыворотки крови. Концентрация lgG в сыворотке крови 6-16 г/л . В процессе первичного иммунного ответа (после первичного введения антигена) он появляется позднее lgM-антител, но образуется раньше при вторичном иммунном ответе (после повторного введения антигена). lgG - единственный класс антител, которые проникают через плаценту и обеспечивают иммунологическую защиту плода, активируют систему комплемента, обладают цитофильной активностью. Благодаря высокому содержанию в сыворотке крови lgG имеет наибольшее значение в противоинфекционном иммунитете. Поэтому об эффективности вакцинации судят по наличию его в сыворотке крови.

Иммуноглобулин М (lgM) имеет молекулярную массу 900000. молекула состоит из 5 (L-Н) 2 -субъединиц, скрепленных дисульфидными связями и дополнительной пептидной цепью (J-цепь). lgM составляет 5-10% от всех иммуноглобулинов сыворотки крови; концентрация его в сыворотке крови 0,5-1,8 г/л . Антитела этого класса образуются при первичном иммунном ответе, Молекула lgM содержит 10 активных центров, поэтому lgM особенно эффективен против микроорганизмов, содержащих в мембране повторяющиеся антигенные детерминанты. lgM обладает высокой агглютинирующей активностью, сильным опсонизирующим эффектом, активирует систему комплемента. В виде мономера является антигенсвязывающим рецептором В-лимфоцитов.

Иммуноглобулин A (lgA) составляет 10-15% от сывороточных иммуноглобулинов; концентрация его в сыворотке 1-5 г/л крови. lgA существует в виде мономера, димера, тримера (L-Н) 2 -субъединицы. В виде секреторного lgA (slgA), устойчивого к протеазам, является основным глобулином экстраваскулярных секретов (слюны, слезной жидкости, носового и бронхиального секретов, поверхности слизистых оболочек желудочно-кишечного тракта). lgA-антитела обладают цитофильной активностью, агглютинируют бактерии, активируют систему комплемента, нейтрализуют токсины, создают защитный барьер в местах наиболее вероятного проникновения инфекционных агентов. Уровень lgA в сыворотке крови возрастает при перинатальных инфекциях, заболеваниях дыхательных путей.

Иммуноглобулин Е (lgE) имеет вид мономера (L-Н) 2 -субъединицы и молекулярную массу около 190000. В сыворотке крови содержится в следовых количествах. Обладает высокой гомоцитотропной активностью, т.е. прочно связывается с тучными клетками соединительной ткани и базофилами крови. Взаимодействие связанных с клетками lgE с родственным антигеном вызывает дегрануляцию тучных клеток, высвобождение гистамина и других вазоактивных субстанций, что приводит к развитию гиперчувствительности немедленного типа. Ранее антитела lgE-класса назывались реагинами.

Иммуноглобулин D (lgD) существует в виде мономерного антитела с молекулярной массой около 180000. Концентрация его в сыворотке крови 0,03-0,04 г/л . lgD в качестве рецептора присутствует на поверхности В-лимфоцитов.

Структура антител и их специфичность . Общий план строения макромолекулы обычно рассматривают в отношении lgG-антател. включающих одну (L-Н) 2 -субъединицу. При ограниченном протеолизе папаином молекулы А этого класса распадаются на два идентичных Fab-фрагмента и Fc-фрагмент. Каждый Fab-фрагмент содержит по одному активному центру, или антидетерминанте, т.к. соединяется с антигеном, но не может его преципитировать. В организации активного центра принимают участие вариабельные участки легкой и тяжелой цепей.

Fc-фрагмент не связывает антиген. В его состав входят константные участки тяжелых цепей. В Fc-фрагменте расположены центры, ответственные за эффекислоторные функции, общие для всех А. одного класса. Схематически молекулу lgG-антител можно представить в виде буквы Y, верхние плечи которой составляют идентичные Fab-фрагменты, а нижний отросток является Fc-фрагментом.

Иммунная система позвоночных способна синтезировать 10 5 - 10 8 молекул А. разной специфичности. Специфичность - важнейшее свойство А., позволяющее им избирательно реагировать с тем антигеном, которым был стимулирован организм. Специфичность А. определяется уникальностью строения антидетерминанты и является результатом пространственного соответствия (комплементарности) между детерминантой антигена и аминокислотными остатками, выстилающими полость анти-детерминанты. Чем выше комплементарность, тем большее число нековалентных связей возникает между детерминантой антигена и аминокислотными остатками антидетерминанты и тем прочнее, стабильнее образующийся иммунный комплекс. Различают аффинность антител, которая является мерой прочности связывания одной антидетерминанты с детерминантой, и авидность антител - суммарную силу взаимодействия поливалентного А. с полидетерминантным антигеном. Хотя А. способны различать незначительные изменения в структуре антигена, известно, что они могут реагировать и с детерминантами сходной структуры. Антитела одной специфичности представлены пулом молекул с разной молекулярной массой, электрофоретической подвижностью и разным сродством к антигену.

Для получения однородных по специфичности и сродству к антигену антител применяют гибридому - гибрид моноклона антителопродуцирующей клетки с клеткой миеломы. Гибридома приобретает способность продуцировать в неограниченном количестве моноклональные А., абсолютно идентичные по классу и типу молекул, по специфичности и сродству к антигену. Моноклональные А. - наиболее перспективное диагностическое и лечебное средство.

Виды антител и их синтез. Различают полные и неполные А. Полные А. имеют в молекуле не менее двух активных центров и при соединении с антигенами дают видимые серологические реакции. Могут быть тепловые и холодовые полные А., которые реагируют с антигеном соответственно при t° 37° или при 4°. Известны двухфазные, биотермические А. Они соединяются с антигеном при низких температурах, а видимый эффект соединения проявляется при 37°. Полные А. могут принадлежать ко всем классам иммуноглобулинов. Неполные А. (моновалентные, непреципитирующие, блокирующие, агглютиноиды) содержат в молекуле одну антидетерминанту вторая антидетерминанта или замаскирована, или обладает низкой аффинностью.

Неполные А. не дают при соединении с антигеном видимых серологических реакций. Их выявляют по способности блокировать реакцию специфического антигена с полными А. той же специфичности либо с помощью антиглобулинового теста - так называемые пробы Кумбса. К неполным А. относятся антитела к резус-фактору.

Нормальные (естественные) А. обнаруживают в крови животных и человека при отсутствии явной инфекции или иммунизации. Антибактериальные нормальные А. возникают, вероятно, в результате постоянного, незаметного контакта с данными бактериями. Предполагают, что они могут определять индивидуальную устойчивость организма к инфекциям. К нормальным А. относят изоантитела, или алло-антитела (см. Группы крови ). Нормальные А., как правило, представлены lgM.

Синтез молекул иммуноглобулинов осуществляется в плазматических клетках. Тяжелые и легкие цепи молекулы синтезируются на разных хромосомах и кодируются разными наборами генов.

Динамика выработки А. в ответ на антигенный стимул зависит от того, впервые или повторно организм сталкивается с данным антигеном. При первичном иммунном ответе появлению А. в крови предшествует латентный период продолжительностью 3-4 дня. Первые образующиеся А. принадлежат к lgM. Затем количество А. резко возрастает и происходит переключение синтеза с lgM- на lgG-антитела. Максимум содержания А. в крови приходится на 7-11-е сутки, после чего их количество постепенно снижается. Для вторичного иммунного ответа характерны укороченный латентный период, более быстрое нарастание титров А. и большее их максимальное значение. Характерно образование сразу lgG-антител. Способность к иммунному ответу по вторичному типу сохраняется в течение многих лет и представляет собой проявление иммунологической памяти, примерами которой может служить противокоревой и противооспенный иммунитет.

Современные теории образования антител . Образование А. является результатом межклеточного взаимодействия, возникающего под влиянием иммуногенного стимула. В клеточной кооперации участвуют три типа клеток: макрофаги (А-клетки). лимфоциты тимусного происхождения (Т-лимфоциты) и лимфоциты костномозгового происхождения (В-лимфоциты). Т- и В-лимфоциты имеют на своей поверхности генетически детерминированные рецепторы для антигенов самой разнообразной специфичности. Т о., распознавание антигена сводится к отбору (селекции) клонов Т- и В-лимфоцитов, несущих рецепторы данной специфичности. Иммунный ответ осуществляется по следующей схеме. Антиген, попадая в организм, поглощается макрофагами и перерабатывается ими в иммуногенную форму, которая распознается иммуноглобулиноподобными рецепторами Т-лимфоцитов (помощников), специфичными к данному антигену. Молекулы антигена, связанные с иммуноглобулиновыми рецепторами, отрываются от Т-лимфоцитов и присоединяются к макрофагам через Fc-рецепторы иммуноглобулинов. На макрофагах образуется таким способом «обойма» антигенных молекул, которая распознается специфическими рецепторами В-лимфоцитов. Только такой массированный сигнал может вызвать пролиферацию и дифференцировку В-лимфоцита (предшественника) в плазматическую клетку. Следовательно, Т- и В-лимфоциты распомают различные детерминанты на одной молекуле антигена. Клеточная кооперация возможна лишь при наличии двойного распознавания.

Феномен двойного распознавания заключается в том, что Т- и В-лимфоциты распознают чужеродную антигенную детерминанту только в комплексе с продуктами генов основного комплекса гистосовместимости своего организма. Известно, что клеточной кооперации между аллогенными клетками не происходит. Вероятно, ассоциация антигенной детерминанты со своими поверхностными структурами осуществляется на поверхности макрофагов в процессе переработки антигена в иммуногенную форму, а также на поверхности лимфоцитов.

Выделение антител и их очистка . Различают неспецифические и специфические методы выделения А. К неспецифическим относят методы фракционирования иммунных сывороток, в результате которых получают фракции, обогащенные А., чаще всего фракцию lgG-антител. К ним относятся высаливание иммуноглобулинов сернокислым аммонием или сернокислым натрием, осаждение иммуноглобулинов спиртом, методы препаративного электрофореза и ионообменной хроматографии и гель-хроматографии. Специфическая очистка основана на выделении А. из комплекса с антигеном и приводит к получению А. одной специфичности, но гетерогенных по физико-химическим свойствам. Процедура состоит из следующих этапов: получение специфического преципитата (комплекса антиген - антитело) и отмывка его от остальных компонентов сыворотки; диссоциация преципитата; отделение А. от антигена на основе различий в их молекулярной массе, заряде и других физико-химических свойств. Для специфического выделения А. широко используют иммуносорбенты - нерастворимые носители, на которых фиксирован антиген. В этом случае процедура получения А. значительно упрощается и включает пропускание иммунной сыворотки через колонку с иммуносорбентом, отмывку иммуносорбента от несвязавшихся белков сыворотки, элюцию фиксированного на иммуносорбенте А. при низких значениях рН и удаление диссоциирующего агента путем диализа.

Библиогр.: Вейсман И.Л., Худ Л.Е. и Вуд У.Б. Введение в иммунологию, пер. с англ., с. 13, М., 1983; Иммунология, под ред. У. Пола, пер. с англ., с. 204, М., 1987; Кульберг А.Я. Молекулярная иммунология, М., 1985; Образование антител, под ред. Л. Глинна и М. Стьюарда, пер. с англ., с. 10, М., 1983, Петров Р.В. Иммунология, с. 35, М., 1987.

АНТИТЕЛА - белки глобулиновой фракции сыворотки крови человека и теплокровных животных, образующиеся в ответ на введение в организм различных антигенов (бактерий, вирусов, белковых токсинов и др.) и специфически взаимодействующие с антигенами, вызвавшими их образование. Связываясь активными участками (центрами) с бактериями или вирусами, антитела препятствуют их размножению или нейтрализуют выделяемые ими токсические вещества. Наличие в крови антител указывает на то, что организм вступал во взаимодействие с антигеном против вызываемой им болезни. В какой степени иммунитет зависит от антител и в какой степени антитела только сопутствуют иммунитету, решается применительно к конкретной болезни. Определение уровня антител в сыворотке крови позволяет судить о напряженности иммунитета даже в тех случаях, когда антитела не играют решающей защитной роли.

Защитное действие антител, содержащихся в иммунных сыворотках, широко используется в терапии и профилактике инфекционных заболеваний (см. Серопрофилактика , Серотерапия). Реакции антител с антигенами (серологические реакции) применяют в диагностике различных заболеваний (см. Серологические исследования).

История

На протяжении длительного времени о хим. природе А. знали очень немного. Известно, что антитела после введения антигена обнаруживаются в сыворотке крови, лимфе, экстрактах тканей и что они специфически реагируют со своим антигеном. О наличии антител судили на основании тех видимых агрегатов, которые образуются при взаимодействии с антигеном (агглютинация, преципитация) или по изменению свойств антигена (нейтрализация токсина, лизис клетки), но о том, с каким химическим субстратом антител связаны, почти ничего не было известно.

Благодаря применению методов ультрацентрифугирования, иммуно-электрофореза и подвижности белков в изоэлектрическом поле доказана принадлежность антител к классу гамма-глобулинов, или иммуноглобулинов.

Антитела представляют собой преформированные в процессе синтеза нормальные глобулины. Иммунные глобулины, полученные в результате иммунизации различных животных одним и тем же антигеном и при иммунизации одного и того же вида животного различными антигенами, обладают неодинаковыми свойствами, так же как неодинаковы сывороточные глобулины различных видов животных.

Классы иммуноглобулинов

Иммуноглобулины вырабатываются иммунокомпетентными клетками лимфоидных органов, различаются между собой по мол. весу, константе седиментации, электрофоретической подвижности, содержанию углеводов и иммунологической активности. Различают пять классов (или типов) иммуноглобулинов:

Иммуноглобулины М (IgM) : молекулярный вес около 1 млн., имеют сложную молекулу; первыми появляются после иммунизации или антигенной стимуляции, оказывают губительное действие на микробы, которые попали в кровь, способствуют их фагоцитозу; слабее, чем иммуноглобулины G, связывают растворимые антигены, токсины бактерии; разрушаются в организме в 6 раз быстрее, чем иммуноглобулины G (например, у крыс период полураспада иммуноглобулина М равен 18 часам, а иммуноглобулина G - 6 дням).

Иммуноглобулины G (IgG) : молекулярный вес около 160 000, их считают стандартными, или классическими, антителами: легко проходят через плаценту; образуются медленнее, чем IgM; наиболее эффективно связывают растворимые антигены, особенно экзотоксины, а также вирусы.

Иммуноглобулины А (IgA) : молекулярный вес около 160 000 или больше, вырабатываются лимфоидной тканью слизистых оболочек, препятствуют деградации ферментов клеток организма и противостоят патогенному действию микробов кишечника, легко проникают через клеточные барьеры организма, содержатся в молозиве, слюне, слезах, слизи кишечника, поте, отделяемом носа, в крови находятся в меньшем количестве, легко соединяются с клетками организма; IgA возникли, по-видимому, в процессе эволюции для защиты слизистых оболочек от агрессии бактериями и передачи пассивного иммунитета потомству.

Иммуноглобулины Е (IgE) : молекулярный вес около 190 000 (по Р. С. Незлину, 1972); по-видимому, ими являются аллергические антитела -так называемые реагины (см. ниже).

Иммуноглобулины D (IgD ): молекулярный вес около 180 000 (по Р. С. Незлину, 1972); в настоящее, время о них известно очень мало.

Структура антител

Молекула иммуноглобулина состоит из двух неидентичных полипептидных субъединиц - легких (L - от английского light) цепей с молекулярным весом 20 000 и двух тяжелых (Н - от английского heavy) цепей с молекулярным весом 60 000. Эти цепи, связанные дисульфидными мостиками, образуют основной мономер LH. Однако в свободном состоянии такие мономеры не встречаются. Большая часть молекул иммуноглобулинов состоит из димеров (LH) 2 , остальные - из полимеров (LH) 2n . Основными N-концевыми аминокислотами человеческого гамма-глобулина являются аспарагиновая и глутаминовая, кроличьего - аланин и аспарагиновая кислота. Портер (R. R. Porter, 1959), воздействуя на иммуноглобулины папаином, нашел, что они распадаются на два (I и II) Fab-фрагмента и Fc-фрагмент (III) с константой седиментации 3,5S и молекулярным весом около 50 000. Основная масса углеводов связана с Fc-фрагментом. По предложению экспертов ВОЗ установлена следующая номенклатура фрагментов антител: Fab-фрагмент - одновалентный, активно соединяющийся с антигеном; Fc-фрагмент - не взаимодействует с антигеном и состоит из С-концевых половин тяжелых цепей; Fd-фраг-мент - участок тяжелой цепи, входящий в Fab-фрагмент. Фрагмент пепсинового гидролиза 5S предложено обозначать как F(ab) 2 , а одновалентный 3,5S-фрагмент - Fab.

Специфичность антител

Одним из важнейших свойств антител является их специфичность, которая выражается в том, что антитела активнее и полнее взаимодействует с тем антигеном, которым организм был стимулирован. Комплекс антиген - антитело в этом случае обладает наибольшей прочностью. Антитела способны различать в антигенах незначительные изменения в структуре. При использовании конъюгированных антигенов, состоящих из белка и включенного простого химического вещества - гаптена, образующиеся антитела специфичны к гаптену, белку и комплексу белок - гаптен. Специфичность обусловлена химической структурой и пространственным рисунком антидетерминант антител (активных центров, реактивных групп), то есть участков антител, которыми они соединяются с детерминантами антигена. Число антидетерминант антител часто называют их валентностью. Так, молекула IgM-антитела может иметь до 10 валентностей, молекулы IgG- и IgA-антител двухвалентны.

По данным Караша (F. Karush, 1962), активные центры IgG состоят из 10-20 аминокислотных остатков, что составляет примерно 1 % всех аминокислот молекулы антител, а, по представлениям Уинклера (М. Н. Winkler, 1963), активные центры состоят из 3-4 аминокислотных остатков. В их составе найдены тирозин, лизин, триптофан и др. Антидетерминанты расположены, очевидно, в аминоконцевых половинах Fab-фрагментов. В образовании активного центра участвуют вариабельные отрезки легких и тяжелых цепей, причем последним принадлежит основная роль. Возможно, легкая цепь лишь частично участвует в формировании активного центра или стабилизирует структуру тяжелых цепей. Наиболее полноценная антидетерминанта создается лишь комбинацией легких и тяжелых цепей. Чем больше точек совпадения связи между антидетерминантами антител и детерминантами антигена, тем выше специфичность. Разная специфичность зависит от последовательности аминокислотных остатков в активном центре антител. Кодирование огромного разнообразия антител по их специфичности неясно. Портер допускает три возможности специфичности .

1. Образование стабильной части молекулы иммуноглобулина контролируется одним геном, а вариабельной части - тысячами генов. Синтезированные пептидные цепи соединяются в молекулу иммуноглобулина под влиянием особого клеточного фактора. Антиген в этом случае выступает в качестве фактора, запускающего синтез антител.

2. Молекула иммуноглобулина кодируется стабильными и изменчивыми генами. В период клеточного деления происходит рекомбинация изменчивых генов, что и обусловливает разнообразие их и вариабельность участков молекул глобулинов.

3. Ген, кодирующий вариабельную часть молекулы иммуноглобулинов, повреждается особым ферментом. Другие ферменты восстанавливают повреждение, но вследствие ошибок допускают различную последовательность нуклеотидов в пределах данного гена. Этим и обусловлена различная последовательность аминокислот в вариабельной части молекулы иммуноглобулина. Имеются и другие гипотезы, напр. Бернета (F. М. Burnet, 1971).

Гетерогенность (неоднородность) антител проявляется по многим признакам. В ответ на введение одного антигена образуются антитела, различающиеся по сродству к антигену, антигенным детерминантам, молекулярному весу, электрофоретической подвижности, N-концевым аминокислотам. Групповые антитела к различным микробам обусловливают перекрестные реакции к разным видам и типам сальмонелл, шигелл, эшерихий, животных белков, полисахаридов. Продуцируемые антитела неоднородны по своей специфичности относительно гомогенного антигена или одной антигенной детерминанты. Гетерогенность антител отмечена не только против белковых и полисахаридных антигенов, но и против комплексных, в том числе конъюгированных, антигенов и против гаптенов. Полагают, что гетерогенность антител определяется известной микрогетерогенностью детерминант антигена. Гетерогенность может быть вызвана образованием антител на комплекс антиген - антитело, что наблюдается при многократной иммунизации, различием клеток, образующих антител, а также принадлежностью антител к разным классам иммуноглобулинов, которые, как и другие белки, обладают сложной антигенной структурой, контролируемой генетически.

Виды антител

Полные антитела имеют не менее двух активных центров и при соединении с антигенами in vitro обусловливают видимые реакции: агглютинацию, преципитацию, связывание комплемента; нейтрализуют токсины, вирусы, опсонизируют бактерии, обусловливают визуальный феномен иммунного прилипания, иммобилизации, набухания капсул, нагрузки тромбоцитов. Реакции протекают в две фазы: специфическая (взаимодействие антитела с антигеном) и неспецифическая (тот или иной из вышеуказанных феноменов). Общепризнано, что различные серологические реакции обусловливаются одним, а не множеством антител и зависят от методики постановки. Различают тепловые полные антитела, реагирующие с антигеном при t° 37°, и холодовые (криофильные), проявляющие эффект при t° ниже 37°. Имеются также антитела, реагирующие с антигеном при низкой температуре, а видимый эффект проявляется при t° 37°; это двухфазные, биотермические антитела, к которым отнесены гемолизины Доната - Ландштейнера. Все известные классы иммуноглобулинов содержат полные антитела. Активность и специфичность их определяются титром, авидностью (см. Авидитет), числом антидетерминант. IgM-антитела более активны, чем IgG-антитела, в реакциях гемолиза и агглютинации.

Неполные антитела (непреципитирующие, блокирующие, агглютиноиды), как и полные антитела, способны соединяться с соответствующими антигенами, но реакция при этом не сопровождается видимым in vitro феноменом преципитации, агглютинации и др.

Неполные антитела обнаружены у человека в 1944 году к резус-антигену, их находили при вирусных, риккетсиозных и бактериальных инфекциях по отношению к токсинам при различных патологических состояниях. Существует ряд доказательств двухвалентности неполных антител. Бактериальные неполные антитела обладают защитными свойствами: антитоксическими, опсонизирующими, бактериологическими; вместе с тем неполные антитела обнаружены при ряде аутоиммунных процессов - при заболеваниях крови, особенно гемолитических анемиях.

Неполные гетеро-, изо- и аутоантитела способны вызвать повреждение клеток, а также играть определенную роль в возникновении медикаментозных лейко- и тромбоцитопении

Нормальными (естественными) принято считать антитела, обычно встречающиеся в сыворотке крови животных и человека при отсутствии явной инфекции или иммунизации. Происхождение антибактериальных нормальных антител может быть связано, в частности, с антигенной стимуляцией нормальной микрофлорой организма. Эти взгляды теоретически и экспериментально обоснованы исследованиями на животных-гнотобионтах и новорожденных в обычных условиях обитания. Вопрос о функциях нормальных антител связан непосредственно со специфичностью их действия. Л. А. Зильбер (1958) полагал, что индивидуальная устойчивость к инфекциям и, кроме того, «иммуногенная готовность организма» определяются их наличием. Показана роль нормальных антител в бактерицидности крови, в опсонизации при фагоцитозе. Работами многих исследователей было показано, что нормальные антитела в основном являются макроглобулина-ми - IgM. Некоторые исследователи находили нормальные антитела в IgA- и IgG-классах иммуноглобулинов. В их составе могут быть как неполные, так и полные антитела (нормальные антитела к эритроцитам - см. Группы крови).

Синтез антител

Синтез антител протекает в две фазы. Первая фаза индуктивная, латентная (1-4 дня), при которой антитела и антителообразующие клетки не обнаруживаются; вторая фаза - продуктивная (начинается после индуктивной фазы), антитела обнаруживаются в плазматических клетках и оттекающей от лимфоидных органов жидкости. После первой фазы антителообразования начинается очень быстрый темп нарастания антител, нередко их содержание может удваиваться каждые 8 часов и даже быстрее. Максимальная концентрация различных антител в сыворотке крови после однократной иммунизации регистрируется на 5, 7,10 или 15-й день; после инъекции депонированных антигенов - на 21- 30-й или 45-й день. Далее через 1-3 или более месяцев титры антител резко падают. Однако иногда низкий уровень антител после иммунизации регистрируется в крови в течение ряда лет. Установлено, что первичная иммунизация большим числом различных антигенов сопровождается появлением вначале тяжелых IgM (19S)-антител, затем в течение короткого срока - IgM и IgG(7S)-антител и, наконец, одних легких 7S-антител. Повторная стимуляция сенсибилизированного организма антигеном вызывает ускорение образования обоих классов антител, укорочение латентной фазы антителообразования, срока синтеза 19S-антител и способствует преимущественному синтезу 7S-антител. Нередко 19S-антитела вовсе не появляются.

Выраженные различия между индуктивной и продуктивной фазой антителообразования обнаруживаются при исследовании их чувствительности к ряду воздействий, что имеет принципиальное значение для понимания природы специфической профилактики. Например, известно, что облучение до иммунизации задерживает или полностью угнетает антителообразование. Облучение в репродуктивную фазу антителообразования не влияет на содержание антител в крови.

Выделение и очистка антител

В целях усовершенствования метода выделения и очистки антител были предложены иммуносорбенты. В основе метода лежит перевод растворимых антигенов в нерастворимые путем присоединения их посредством ковалентных связей к нерастворимой основе из целлюлозы, сефадекса или другого полимера. Метод позволяет получить в высокой степени очищенные антитела в больших количествах. Процесс выделения антител с помощью иммуносорбентов включает три этапа:

1) извлечение антител из иммунной сыворотки;

2) отмывание иммуносорбента от неспецифических белков;

3) отщепление антител от отмытого иммуносорбента (обычно буферными растворами с низкими значениями pH). Кроме этого метода, известны и другие методы очистки антител. Их можно разделить на две группы: специфические и неспецифические. В основе первых лежит диссоциация антител из комплекса нерастворимый антиген - антитело (преципитат, агглютинат). Она осуществляется различными веществами; широко распространен метод ферментативного переваривания антигена или флоккулята токсин - антитоксин амилазой, трипсином, пепсином. Используется также тепловая элюция при t° 37-56°.

Неспецифические методы очистки антител основаны на выделении гамма-глобулинов: электрофорез в геле, хроматография на ионообменных смолах, фракционирование гель-фильтрацией через сефадексы. Широко известен метод осаждения сернокислым натрием или аммонием. Эти методы применимы в случаях высокой концентрации антител в сыворотке, например, при гипериммунизации.

Гельфильтрация через сефадексы, а также использование ионообменных смол позволяют разделить антитела по величине их молекул.

Применение антител

Антитела, особенно гамма-глобулины, применяются для терапии и профилактики дифтерии, кори, столбняка, газовой гангрены, сибирской язвы, лептоспирозов, против стафилококков, возбудителей бешенства, гриппа и др. Специально приготовленные и очищенные диагностические сыворотки применяются в серологической идентификации возбудителей инфекций (см. Идентификация микробов). Было установлено, что пневмококки, стафилококки, сальмонеллы, бактериофаги и др., адсорбируя соответствующие антитела, прилипают к тромбоцитам, эритроцитам и другим чужеродным частицам. Этот феномен назван иммунным прилипанием. Было показано, что в механизме этого феномена играют роль белковые рецепторы тромбоцитов и эритроцитов, которые разрушаются трипсином, папаином и формалином. Реакция иммунного прилипания зависит от температуры. Ее учитывают по прилипанию корпускулярного антигена или по гемагглютинации, обусловленной растворимым антигеном в присутствии антител и комплемента. Реакция высокочувствительна и может быть использована как для определения комплемента, так и очень небольших (0,005-0,01 мкг азота) количеств антител. Иммунное прилипание усиливает фагоцитоз лейкоцитами.

Современные теории образования антител

Различают инструктивные теории антителообразования, согласно к-рым антиген прямо или косвенно участвует в формировании специфических иммуноглобулинов, и теории, предполагающие образование генетически предсуществующих антител ко всем возможным антигенам или клеток, синтезирующих эти антитела. К ним относятся селекционные теории и теория репрессии - дерепрессии, допускающая возможность синтеза одной клеткой любых антител. Предложены также теории, стремящиеся осмыслить процессы иммунологического ответа на уровне целостного организма с учетом взаимодействия различных клеток и общепринятых представлений о синтезе белка в организме.

Теория прямой матрицы Гауровитца-Полинга сводится к тому, что антиген, поступив внутрь клеток, вырабатывающих антитела, играет роль матрицы, оказывающей влияние на образование молекулы иммуноглобулина из пептидных цепей, синтез которых протекает без участия антигена. «Вмешательство» антигена наступает лишь во второй фазе формирования белковой молекулы - фазе скручивания пептидных цепей. Антиген так изменяет концевые N-аминокислоты будущего антитела (иммуноглобулина или его отдельных пептидных цепей), что они становятся комплементарными к детерминантам антигена и легко вступают с ним в связь. Образовавшееся таким образом антитела отщепляется от антигена, поступает в кровь, а освободившийся антиген принимает участие в формировании новых молекул антител. Эта теория вызвала ряд серьезных возражений. Она не может объяснить образования иммунологической толерантности; превосходящего количества вырабатываемых клеткой антител в единицу времени на имеющееся в ней во много раз меньшее число молекул антигена; продолжительности выработки антител организмом, исчисляемой годами или всей жизнью, по сравнению со значительно меньшим сроком сохранения антигена в клетках и т. д. Следует также учесть, что клетки плазматического или лимфоидного ряда, вырабатывающие антитела, не ассимилируют антиген, хотя присутствие нативного антигена или его фрагментов в антителосинтезирующих клетках полностью исключить нельзя. В последнее время Гауровитцем (F. Haurowitz, 1965) предложена новая концепция, по которой антиген изменяет не только вторичную, но и первичную структуру иммуноглобулина.

Теория непрямой матрицы Бернета - Феннера получила известность в 1949 году. Ее авторы считали, что макромолекулы антигена и скорее всего его детерминанты проникают в ядра клеток зародышевого типа и вызывают наследственно закрепленные изменения в них, следствием которых является образование антител к данному антигену. Допускается аналогия между описываемым процессом и трансдукцией у бактерий. Приобретенное клетками новое качество образования иммунных глобулинов передается потомству клеток в бесчисленных поколениях. Однако вопрос о роли антигена в описываемом процессе оказался спорным.

Именно это обстоятельство явилось причиной возникновения теории естественной селекции Ерне (K. Jerne, 1955).

Теория естественной селекции Ерне. Согласно этой теории антиген не является матрицей для синтеза антител и не вызывает генетических изменений в клетках-продуцентах антител. Его роль сводится к селекции имеющихся «нормальных» антител, спонтанно возникающих к различным антигенам. Происходит это будто бы так: антиген, попав в организм, находит соответствующее антитело, соединяется с ним; образовавшийся комплекс антиген - антитело поглощается клетками, вырабатывающими антитела, и последние получают стимул производить антитела именно такого рода.

Клонально-селекционная теория Бернета (F. Burnet) явилась дальнейшим развитием идеи Ерне о селекции, но не антител, а клеток, производящих антитела. Бернет полагает, что в результате общего процесса дифференциации в эмбриональном и постнатальном периодах из мезенхимальных клеток образуется множество клонов лимфоидных или иммунологически компетентных клеток, способных реагировать с различными антигенами или их детерминантами и вырабатывать антитела - иммуноглобулины. Характер реагирования лимфоидных клеток на антиген в эмбриональном и постнатальном периодах различен. Зародыш либо совсем не вырабатывает глобулинов, либо синтезирует их немного. Однако допускается, что те его клоны клеток, которые способны вступить в реакцию с антигенными детерминантами собственных белков, реагируют с ними и в результате этой реакции уничтожаются. Так, вероятно, погибают клетки, образующие анти-А-агглютинины у лиц с группой крови А и анти-В-агглютинины - у лиц с группой крови В. Если эмбриону ввести какой-либо антиген, то аналогичным образом он уничтожит соответствующий клон клеток, и новорожденный в течение всей последующей жизни теоретически будет толерантным к данному антигену. Процесс уничтожения всех клонов клеток к собственным белкам зародыша заканчивается к моменту его рождения или выхода из яйца. Теперь у новорожденного осталось только «свое», и любое «чужое», попавшее в его организм, он распознает. Бернет допускает также сохранение «запретных» клонов клеток, способных реагировать с аутоантигенами органов, которые в процессе развития были изолированы от клеток, вырабатывающих антитела. Распознавание «чужого» обеспечивается оставшимися клонами мезенхимальных клеток, на поверхности которых имеются соответствующие антидетерминанты (рецепторы, клеточные антитела), комплементарные к детерминантам «чужого» антигена. Природа рецепторов детерминирована генетически, то есть закодирована в хромосомах и не привносится в клетку вместе с антигеном. Наличие готовых рецепторов неизбежно ведет к реакции данного клона клеток с данным антигеном, следствием которой теперь являются два процесса: образование специфических антител - иммуноглобулинов и размножение клеток данного клона. Бернет допускает, что мезенхимальная клетка, получившая антигенное раздражение, в порядке митоза дает начало популяции дочерних клеток. Если такая клетка осела в мозговом веществе лимфатического узла, она дает начало образованию плазматических клеток, при оседании в лимфатических фолликулах - лимфоцитам, в костном мозге - эозинофилам. Дочерние клетки склонны к соматическим необратимым мутациям. При расчете на весь организм число мутирующих клеток за сутки может составить 100 ООО или 10 млн., и, следовательно, мутации обеспечат клоны клеток к любому антигену. Теория Бернета вызвала огромный интерес исследователей и большое число проверочных экспериментов. Важнейшими подтверждениями теории явились доказательства присутствия на предшественниках антителопродуцирующих клеток (лимфоцитах костномозгового происхождения) антителоподобных рецепторов иммуноглобулиновой природы и наличия в антителопродуцирующих клетках механизма интерцистронного исключения в отношении антител различной специфичности.

Теория репрессии и дерепрессии сформулирована Силардом (L. Szilard) в 1960 году. Согласно этой теории каждая клетка, вырабатывающая антитело, потенциально может синтезировать любое антитело к любому антигену, но этот процесс у нее заторможен репрессором фермента, участвующего в синтезе иммуноглобулина. В свою очередь образование репрессора может затормозиться влиянием антигена. Силард считает, что образование антител контролируется особыми неудваивающимися генами. Число их достигает 10 000 на каждый одинарный (гаплоидный) набор хромосом.

Ледерберг (J. Lederberg) считает, что в генах, ответственных за синтез глобулинов, имеются участки, контролирующие образование активных центров антител. В норме функция названных участков заторможена, и поэтому идет синтез нормальных глобулинов. Под влиянием антигена, а также, возможно, под действием некоторых гормонов происходит растормаживание и стимулирование деятельности участков гена, ответственных за образование активных центров антител, и клетка начинает синтезировать иммунные глобулины.

По мнению H. Н. Жукова-Вережникова (1972), эволюционными предшественниками антител были защитные ферменты, аналогичные появляющимся у бактерий с приобретенной антибиотикорезистентностью. Как и антитела, ферменты состоят из активной (по отношению к субстрату) и пассивной частей молекулы. В силу экономичности механизм «один фермент - один субстрат» сменился механизмом «единых молекул с варьирующей частью», то есть антител с вариабельными активными центрами. Информация об антителообразовании реализуется в зоне «резервных генов», или в «зоне избыточности» на ДНК. Такая избыточность, видимо, может локализоваться в ядерной или плазмидной ДНК, которая хранит «эволюционную информацию..., игравшую роль внутреннего механизма, „начерно“ контролирующего наследственную изменчивость». Эта гипотеза содержит инструктивный компонент, но не является полностью инструктивной.

П. Ф. Здродовский отводит антигену роль дерепрессора определенных генов, контролирующих синтез комплементарных антител. Одновременно антиген, как допускает Здродовский в соответствии с теорией Селье, раздражает аденогипофиз, в результате чего происходит выработка соматотропное (СТГ) и адренокортикотропного (АКТГ) гормонов. СТГ стимулирует плазмоцитарную и антителообразующую реакцию лимфоидных органов, в свою очередь стимулированных антигеном, а АКТГ, воздействуя на кору надпочечников, вызывает выделение ею кортизона. Этот последний в иммунном организме угнетает плазмоцитарную реакцию лимфоидных органов и синтез клетками антител. Все эти положения были подтверждены экспериментально.

Действие системы гипофиз - надпочечники на продукцию антител может выявляться лишь в предварительно иммунизированном организме. Именно эта система организует анамнестические серологические реакции в ответ на введение в организм различных неспецифических раздражителей.

Углубленное изучение клеточных изменений в процессе иммунологического ответа и накопление большого количества новых фактов обосновали положение, согласно которому иммунологический ответ осуществляется лишь в результате кооперированного взаимодействия определенных клеток. В соответствии с этим предложено несколько гипотез.

1. Теория кооперации двух клеток. Накоплено много фактов, свидетельствующих о том, что иммунологический ответ в организме осуществляется в условиях взаимодействия различных типов клеток. Имеются подтверждения того, что макрофаги первыми ассимилируют и модифицируют антиген, но в последующем «инструктируют» лимфоидные клетки о синтезе антител. Одновременно показано, что происходит кооперация и между лимфоцитами, относящимися к различным субпопуляциям: между Т-лимфоцитами (тимусзависимые, антнгенреактивные, происходящие из вилочковой железы) и В-клетками (тимуснезависимые, предшественники антителообразующих клеток, костномозговые лимфоциты).

2. Теории кооперации трех клеток. Согласно взглядам Ройтта (I. Roitt) и др. (1969) антиген захватывается и перерабатывается макрофагами. Такой антиген стимулирует антигенреактивные лимфоциты, подвергающиеся трансформации в бластоидные клетки, обеспечивающие гиперчувствительность замедленного типа и превращающиеся в долгоживущие клетки иммунологической памяти. Эти клетки вступают в кооперацию с антителообразующими клетками-предшественниками, которые в свою очередь дифференцируются, пролиферируя в антителопродуцирующие клетки. По мнению Рихтера (М. Richter, 1969), большинство антигенов обладает слабым сродством для антителообразующих клеток, поэтому для выработки антител необходимо следующее взаимодействие процессов: антиген+макрофаг - переработанный антиген+антигенреактивная клетка - активированный антиген+предшественник антителообразующей клетки - антитела. В случае высокого сродства антигена процесс будет выглядеть так: антиген+предшественник антителообразующих клеток - антитела. Предполагается, что в условиях повторного стимулирования антигеном последний непосредственно вступает в контакт с антителообразующей клеткой или клеткой иммунологической памяти. Это положение подтверждается большей радиорезистентностью повторного иммунологического ответа, чем первичного, что объясняется различной устойчивостью клеток, участвующих в иммунологическом ответе. Постулируя необходимость трехклеточного кооперирования в антителогенезе, Р. В. Петров (1969, 1970) считает, что синтез антител произойдет лишь в том случае, если стволовая клетка (предшественник антителообразующей клетки) одновременно получит из макрофага переработанный антиген, а из антигенреактивной клетки индуктор иммунопоэза, образуемый после ее (антигенреактивной клетки) стимуляции антигеном. Если происходит контакт стволовой клетки только с переработанным макрофагом антигеном, то создается иммунологическая толерантность (см. Толерантность иммунологическая). Если же налицо контакт стволовой клетки только с антигенреактивной клеткой, то происходит синтез неспецифического иммуноглобулина. Предполагается, что эти механизмы лежат в основе инактивации несингенных стволовых клеток лимфоцитами, так как индуктор иммунопоэза, попадая в аллогенную стволовую клетку, является для нее антиметаболитом (сингенные - клетки с идентичным геномом, аллогенные - клетки того же вида, по с иным генетическим составом).

Аллергические антитела

Аллергические антитела - специфические иммуноглобулины, образующиеся под действием аллергенов у человека и животных. При этом имеются в виду циркулирующие в крови антитела при аллергических реакциях немедленного типа. Различают три основных вида аллергических антител: кожно-сенсибилизирующие, или реагины; блокирующие и гемагглютинирующие. Биологические, химические и физико-химические свойства аллергических антител человека своеобразны (табл .).

Эти свойства резко отличаются от свойств преципитирующих, комплементсвязывающих антител, агглютининов и других, описываемых в иммунологии.

Реагинами принято обозначать гомологические кожно-сенсибилизирующие антитела человека. Это важнейший вид аллергических антител человека, основным свойством которых является способность осуществлять реакцию пассивного переноса повышенной чувствительности на кожу здорового реципиента (см. Прауснитца-Кюстнера реакция). Реагины обладают целым рядом характерных свойств, отличающих их от сравнительно хорошо изученных иммунных антител. Многие вопросы, касающиеся свойств реагинов и их иммунологической природы, остаются, однако, нерешенными. В частности, нерешенным является вопрос о гомогенности или гетерогенности реагинов в смысле их принадлежности к определенному классу иммуноглобулинов.

Блокирующие антитела возникают у больных поллинозами в процессе специфической гипосенсибилизирующей терапии к тому антигену, которым производится гипосенсибилизация. Свойства этого вида антител напоминают свойства преципитирующих антител.

Под гемагглютинирующими антителами обычно подразумевают антитела сыворотки крови человека и животных, способные специфически агглютинировать эритроциты, соединенные с пыльцевым аллергеном (реакция непрямой, или пассивной, гемагглютинации). Связывание поверхности эритроцита с аллергеном пыльцы достигается разнообразными методами, напр, с помощью танина, формалина, дважды диазотированного бензидина. Гемагглютинирующие антитела удается обнаружить у людей, имеющих повышенную чувствительность к пыльце растений, как до, так и после специфической гипосенсибилизирующей терапии. В процессе этой терапии происходит трансформация отрицательных реакций в положительные или повышение титров реакции гемагглютинации. Гемагглютинирующие антитела обладают свойством довольно быстро адсорбироваться на эритроцитах, обработанных пыльцевым аллергеном, особенно некоторыми его фракциями. Иммуносорбенты удаляют гемагглютинирующие антитела быстрее, чем реагины. Гемагглютинирующая активность связана в некоторой степени и с кожно-сенсибилизирующими антителами, однако роль кожно-сенсибилизирующих антител в гемагглютинации, по-видимому, невелика, так как не существует никакой корреляции между кожно-сенсибилизирующими и гемагглютинирующими антителами. С другой стороны, существует корреляция между гемагглютинирующими и блокирующими антителами как у лиц с аллергией к пыльце растений, так и у здоровых лиц, иммунизированных растительной пыльцой. Эти два вида антител обладают многими сходными свойствами. В процессе специфической гипосенсибилизирующей терапии происходит повышение уровня как того, так и другого вида антител. Гемагглютинирующие антитела к пенициллину не идентичны кожно-сенсибилизирующим антителам. Основной причиной образования гемагглютинирующих антител явилась пенициллинотерапия. По-видимому, гемагглютинирующие антитела следует отнести к группе антител, именуемых рядом авторов «антитела ми-свидетелями».

В 1962 году Шелли (W. Shelley) предложил специальный диагностический тест, основанный на так называемые дегрануляции базофильных лейкоцитов крови кролика под действием реакции аллергена со специфическим антителами. Однако характер антител, которые принимают участие в данной реакции, и связь их с циркулирующими реагинами недостаточно выяснены, хотя имеются данные о корреляции этого вида антител с уровнем реагинов у больных поллинозом.

Установление оптимальных соотношений аллергена и исследуемой сыворотки является чрезвычайно важным в практическом отношении, особенно при исследованиях с видами аллергенов, сведения о которых еще не содержатся в соответствующей литературе.

К аллергическим антителам животных можно отнести следующие виды антител: 1) антитела при экспериментальной анафилаксии; 2) антитела при спонтанных аллергических заболеваниях животных; 3) антитела, играющие роль при развитии реакции Артюса (типа преципитирующих). При экспериментальной анафилаксии, как общей, так и местной, в крови животных обнаруживают специальные виды анафилактических антител, обладающих свойством пассивно сенсибилизировать кожу животных того же вида.

Было показано, что анафилактическая сенсибилизация морских свинок аллергенами пыльцы тимофеевки луговой сопровождается циркуляцией в крови кожно-сенсибилизирующих антител Эти кожно-сенсибилизирующие тела обладают свойством осуществлять гомологическую пассивную сенсибилизацию кожи in vivo. Наряду с этими гомологическими кожно-сенсибилизирующими антителами при общей сенсибилизации морских свинок аллергенами пыльцы тимофеевки луговой в крови циркулируют антитела, выявляемые реакцией пассивной гемагглютинации с бис-диазотированным бензидином. Кожно-сенсибилизирующие антитела, осуществляющие гомологичный пассивный перенос и имеющие положительную корреляцию с показателем анафилаксии, относят к группе гомологических анафилактических антител, или гомоцитотропных антител. Употребляя термин «анафилактические антитела», авторы приписывают им ведущую роль в реакции анафилаксии. Стали появляться исследования, подтверждающие существование гомоцитотропных антител к белковым антигенам и конъюгатам у различных видов экспериментальных животных. Ряд авторов выделяет три вида антител, участвующих в аллергических реакциях немедленного типа. Это антитела, связанные с новым типом иммуноглобулинов (IgE) у человека и аналогичные антитела у обезьян, собак, кроликов, крыс, мышей. Второй вид антител - антитела типа морской свинки, способные фиксироваться на тучных клетках и изологичных тканях. Они отличаются рядом свойств, в частности, они более термостабильны. Считают, что антитела типа IgG могут быть и у человека вторым видом анафилактических антител. Третий вид - антител, сенсибилизирующие гетерологичные ткани, принадлежащие, например, у морских свинок к классу γ 2 . У человека только антитела типа IgG обладают способностью сенсибилизировать кожу морской свинки.

При заболеваниях животных описаны аллергические антитела, образующиеся при спонтанных аллергических реакциях. Эти антитела термолабильны, обладают кожно-сенсибилизирующими свойствами.

Неполные антитела в судебно-медицинском отношении применяются при определении антигенов ряда изосерологических систем (см. Группы крови) для установления принадлежности крови определенному лицу в случаях уголовных преступлений (убийства, половые преступления, транспортные происшествия, нанесение телесных повреждений и др.), а также при экспертизе спорного отцовства и материнства. В отличие от полных антител, они не вызывают агглютинации эритроцитов в солевой среде. Среди них различают антитела двух видов. Первый из них - агглютиноиды. Эти антитела способны вызвать склеивание эритроцитов в белковой или макромолекулярной среде. Второй вид антител - криптагглютиноиды, которые реагируют в непрямой пробе Кумбса с антигаммаглобулиновой сывороткой.

Для работы с неполными антителами предложен ряд методов, подразделяющихся на три основные группы.

1. Методы конглютинации. Отмечено, что неполные антитела способны вызывать агглютинацию эритроцитов в белковой или макромолекулярной среде. В качестве таких сред используют сыворотку крови группы AB (не содержащую антител), бычий альбумин, декстран, биогель - особо очищенную желатину, приведенную буферным раствором к нейтральному pH, и др. (см. Конглютинация).

2. Ферментные методы. Неполные антитела способны вызвать агглютинацию эритроцитов, предварительно подвергнутых обработке некоторыми ферментами. Для такой обработки применяют трипсин, фицин, папаин, экстракты из хлебных дрожжей, протелин, бромелин и др.

3. Проба Кумбса с антиглобулиновой сывороткой (см. Кумбса реакция).

Неполные антитела, относящиеся к агглютиноидам, могут проявить свое действие во всех трех группах методов. Антитела, относящиеся к криптагглютиноидам, не способны агглютинировать эритроциты не только в солевом растворе, но и в макромолекулярной среде, а также блокировать их в последней. Эти антитела открываются только в непрямой пробе Кумбса, с помощью которой открываются не только антитела, относящиеся к криптагглютиноидам, но и антитела, являющиеся агглютиноидами.

Моноклональные антитела

Из дополнительных материалов, том 29

Классический способ производства антител для диагностических и исследовательских целей заключается в иммунизации животных определенными антигенами и последующем получении иммунных сывороток, содержащих антитела необходимой специфичности. Этот метод имеет ряд недостатков, связанных прежде всего с тем, что иммунные сыворотки включают разнородные и гетерогенные популяции антител, различающихся по активности, аффинности (сродству к антигену) и биологическому действию. Обычные иммунные сыворотки содержат смесь антител, специфичных как в отношении заданного антигена, так и в отношении контаминирую-щих его белковых молекул. Новый тип иммунологических реагентов представляют собой моноклональные антитела, получаемые с помощью клонов гибридных клеток - гибридом (см.). Несомненным преимуществом моноклональных антител является их генетически предопределенная стандартность, неограниченная воспроизводимость, высокая чувствительность и специфичность. Первые гибридомы были выделены в начале 70-х годов 20 века, однако реальное освоение эффективной технологии создания моноклональных антител связано с исследованиями Келера и Милыптейна (G. Kohler, С. Milstein), результаты которых были опубликованы в 1975- 1976 годы. В последующее десятилетие новое направление клеточной инженерии, связанное с получением моноклональных антител, получило дальнейшее развитие.

Гибридомы образуются при слиянии лимфоцитов гипериммунизированных животных с клетками перевиваемых плазмоцитом различного происхождения. Гибридомы наследуют от одного из родителей способность продуцировать специфические иммуноглобулины, а от второго - свойство неограниченно размножаться. Клонированные популяции гибридных клеток могут длительное время продуцировать генетически однородные иммуноглобулины заданной специфичности - моноклональные антитела. Наиболее широко применяются моноклональные антитела, продуцируемые гибридомами, полученными с использованием уникальной мышиной клеточной линии МОРС 21 (РЗ).

К труднопреодолимым проблемам технологии моноклональных антител относятся сложность и трудоемкость получения устойчивых высокопродуктивных гибридных клонов, вырабатывающих моноспецифические иммуноглобулины; сложность получения гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к слабым антигенам, неспособным индуцировать образование стимулированных В-лимфоцитов в достаточном количестве; отсутствие у моноклональных антител некоторых свойств иммунных сывороток, напр, свойства образовывать преципитаты с комплексами других антител и антигенов, на котором основаны многие диагностические тест-системы; низкая частота слияния лимфоцитов, продуцирующих антитела, с миеломными клетками и ограниченная стабильность гибридом в массовых культурах; низкая стабильность в процессе хранения и повышенная чувствительность препаратов моноклональных антител к изменениям pH, температуры инкубации, а также к замораживанию, оттаиванию и воздействию химических факторов; сложность получения гибридом или перевиваемых продуцентов человеческих моноклональных антител.

Практически все клетки в популяции клонированных гибридом продуцируют моноклональные антитела одного и того же класса и подкласса иммуноглобулинов. Моноклональные антитела можно модифицировать с помощью методов клеточной иммунной инженерии. Так, можно получать «триомы» и «квадромы», продуцирующие моноклональные антитела двойной заданной специфичности, изменять продукцию пента-мерных цитотоксических IgM на продукцию пентамерных нецитотоксических IgM, мономерных нецитотоксических IgM или IgM с уменьшенной аффинностью, а также переключать (с сохранением антигенной специфичности) секрецию IgM на секрецию IgD, а секрецию IgGl - на секрецию IgG2a, IgG2b или IgA.

Мышиный геном обеспечивает синтез свыше 1*10 7 различных вариантов антител, специфически взаимодействующих с эпитопами (антигенными детерминантами) белковых, углеводных или липидных антигенов, присутствующих в клетках или микроорганизмах. Возможно образование тысяч различных антител к одному антигену, отличающихся по специфичности и аффинности; например, в результате иммунизации однородными человеческими клетками индуцируется до 50 000 различных антител. Использование гибридом позволяет отбирать практически все варианты моноклональных антител, которые могут быть индуцированы к данному антигену в организме экспериментального животного.

Многообразие моноклональных антител, получаемых к одному и тому же белку (антигену), обусловливает необходимость определения их более тонкой специфичности. Характеристика и отбор иммуноглобулинов с требуемыми свойствами среди многочисленных видов моноклональных антител, взаимодействующих с исследуемым антигеном, превращаются зачастую в более трудоемкую экспериментальную работу, чем получение моноклональных антител. Эти исследования включают разделение набора антител на группы, специфичные к тем или иным эпитопам, с последующим отбором в каждой группе оптимального варианта по аффинности, стабильности и другим параметрам. Для определения эпитопной специфичности наиболее часто используют метод конкурентного иммуноферментного анализа.

Рассчитано, что первичная последовательность из 4 аминокислот (обычный размер эпитопа) может встречаться до 15 раз в последовательности аминокислот белковой молекулы. Однако перекрестные реакции с моноклональными антителами наблюдаются с гораздо меньшей частотой, чем можно было бы ожидать, исходя из этих расчетов. Происходит это потому, что далеко не все указанные участки экспрессируются на поверхности белковой молекулы и узнаются антителами. Кроме того, моноклональные антитела обнаруживают последовательности аминокислот только в определенной конформации. Следует учитывать и то обстоятельство, что последовательность аминокислот в белковой молекуле не распределяется среднестатистически, а участки связывания антител бывают значительно крупнее, чем минимальный эпитоп, содержащий 4 аминокислоты.

Использование моноклональных антител открыло недоступные ранее возможности для изучения механизмов функциональной активности иммуноглобулинов. Впервые с помощью моноклональных антител удалось выявить антигенные различия у белков, ранее серологически неразличимых. Были установлены новые субтиповые и штаммовые различия между вирусами и бактериями, открыты новые клеточные антигены. С помощью моноклональных антител обнаружены антигенные связи между структурами, существование которых невозможно было достоверно доказать с использованием поликлональных (обычных иммунных) сывороток. Применение моноклональных антител позволило идентифицировать консервативные антигенные детерминанты вирусов и бактерий, обладающие широкой групповой специфичностью, а также штаммоспецифические эпитопы, отличающиеся большой вариабельностью и изменчивостью.

Принципиальное значение имеет обнаружение с помощью моноклональных антител антигенных детерминант, индуцирующих выработку защитных и нейтрализующих антител к возбудителям инфекционных болезней, что важно для создания лечебно-профилактических препаратов. Взаимодействие моноклональных антител с соответствующими эпитопами может приводить к возникновению стерических (пространственных) препятствий для проявления функциональной активности белковых молекул, а также к аллостерическим изменениям, которые преобразуют конформацию активного участка молекулы и блокируют биологическую активность белка.

Только с помощью моноклональных антител удалось исследовать механизмы кооперативного действия иммуноглобулинов, взаимного потенцирования или взаимного ингибирования антител, направленных к различным эпитопам одного и того же белка.

Для производства массовых количеств моноклональных антител чаще используют асцитные опухоли мышей. Более чистые препараты моноклональных антител могут быть получены на бессывороточных средах в ферментируемых суспензионных культурах или в диализных системах, в микроинкапсулированных культурах и устройствах типа капиллярных культур. Для получения 1 г моноклональных антител требуется примерно 0,5 л асцитной жидкости или 30 л культуральной жидкости, инкубированной в ферментерах со специфическими гибридомными клетками. В производственных условиях вырабатывают очень большие количества моноклональных антител. Значительные затраты на производство моноклональных антител оправдываются высокой эффективностью очистки белков на иммобилизованных моноклональных антителах, причем коэффициент очистки белка в одноступенчатой процедуре аффинной хроматографии достигает нескольких тысяч. Аффинная хроматография на основе моноклональных антител применяется при очистке гормона роста, инсулина, интерферонов, интерлейкинов, продуцируемых измененными с помощью методов генетической инженерии штаммами бактерий, дрожжей или эукариотических клеток.

Быстро развивается использование моноклональных антител в составе диагностических наборов. К 1984 году в США было рекомендовано для клинических исследований около 60 диагностических тест-систем, приготовленных с применением моноклональных антител. Основное место среди них занимают тест-системы для ранней диагностики беременности, определения содержания в крови гормонов, витаминов, лекарственных препаратов, лабораторной дртгностики инфекционных болезней.

Сформулированы критерии отбора моноклональных антител для их использования в качестве диагностических реагентов. К ним относятся высокая аффинность к антигену, обеспечивающая связывание при низкой концентрации антигена, а также эффективная конкуренция с антителами организма хозяина, уже связавшимися с антигенами в исследуемом образце; направленность против антигенного участка, обычно не распознаваемого антителами организма хозяина и потому не маскированного этими антителами; направленность против повторяющихся антигенных детерминант поверхностных структур диагностируемого антигена; поливалентность, обеспечивающая более высокую активность IgM по сравнению с IgG.

Моноклональные антитела можно использовать в качестве диагностических препаратов для определения гормонов и лекарственных препаратов, токсических соединений, маркеров злокачественных опухолей, для классификации и подсчета лейкоцитов, более точного и быстрого определения групповой принадлежности крови, для выявления антигенов вирусов, бактерий, простейших, для диагностики аутоиммунных заболеваний, обнаружения аутоантител, ревматоидных факторов, определения классов иммуноглобулинов в сыворотке крови.

Моноклональные антитела позволяют успешно дифференцировать поверхностные структуры лимфоцитов и с большой точностью идентифицировать основные субпоиуля-ции лимфоцитов, классифицировать на семейства клетки лейкозов и лимфом человека. Новые реагенты на основе моноклональных антител облегчают процедуру определения В-лимфоцитов и Т-лимфоцитов, подклассов Т-лимфоцитов, превращая ее в один из простых этапов подсчета формулы крови. С помощью моноклональных антител можно избирательно удалять ту или иную субпопуляцию лимфоцитов, выключая соответствующую функцию системы клеточного иммунитета.

Обычно диагностические препараты на базе моноклональных антител содержат иммуноглобулины, меченные радиоактивным йодом, пероксидазой или другим ферментом, применяемым в иммуноферментных реакциях, а также флюорохромами, например флюоресцеинизотиоцианатом, используемыми в иммунофлюоресцентном методе. Высокая специфичность моноклональных антител представляет особую ценность при создании усовершенствованных диагностических препаратов, повышении чувствительности и специфичности радиоиммуно логических, иммуноферментных, иммунофлюорес-центных методов серологического анализа, типировании антигенов.

Терапевтическое применение моноклональных антител может оказаться эффективным при необходимости нейтрализации токсинов различного происхождения, а также антигеноактивных ядов, для достижения иммунодепрессии при трансплантации органов, для индукции зависимого от комплемента цитолиза опухолевых клеток, для коррекции состава Т-лимфоцитов и иммунорегуляции, для нейтрализации бактерий, устойчивых к антибиотикам, пассивной иммунизации против патогенных вирусов.

Основным препятствием на пути терапевтического использования моноклональных антител является возможность развития побочных иммунологических реакций, связанных с гетерологичным происхождением моноклональных иммуноглобулинов. Для преодоления этого необходимо получение человеческих моноклональных антител. Успешные исследования в этом направлении позволяют применять моноклональные антитела в качестве векторов для целенаправленной доставки ковалентно связанных лекарственных препаратов.

Разрабатываются терапевтические препараты, специфичные к строго определенным клеткам и тканям и обладающие направленной цитотоксичностью. Это достигается конъюги-рованием высокотоксичных белков, напр, дифтерийного токсина, с моноклональными антителами, узнающими клетки-мишени. Направляемые моноклональными антителами, химиотерапевтические агенты способны избирательно уничтожать в организме опухолевые клетки, несущие специфический антиген. Моноклональные антитела могут выполнять роль вектора и при встраивании в поверхностные структуры липосом, что обеспечивает доставку к органам или клеткам-мишеням значительных количеств лекарственных препаратов, заключенных в липосомах.

Последовательное применение моноклональных антител не только повысит информативность обычных серологических реакций, но и подготовит появление принципиально новых подходов к исследованию взаимодействия антигенов и антител.

СВОЙСТВА РАЗЛИЧНЫХ ВИДОВ АЛЛЕРГИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ ПРИ РЕАКЦИЯХ НЕМЕДЛЕННОГО ТИПА [по данным Сихона (A. Sehon), 1965; Стануорта (D. Stanworth), 1963, 1965]

Исследуемые параметры	Виды антител
	кожно-сенсибилизирующие (реагины)	блокирующие	гемагглютинирующие
Принцип определения антител	Реакция с аллергеном в коже	Блокирование реакции аллерген- реагин в коже	Реакция непрямой гемагглютинации в пробирке
Устойчивость при t° 50°	Термолабильные	Термостабильные	Термостабильные
Способность проходить через плаценту	Отсутствует		Нет данных
Способность осаждаться 30% сернокислым аммонием	Не осаждаются	Осаждаются	Частично осаждаются, частично остаются в растворе
Хроматография на ДЕАЕ -Целлюлозе	Рассеяны в нескольких фракциях	В 1-й фракции	В 1-й фракции
Абсорбция иммуно-сорбентами	Медленная	Нет данных
Преципитация с пыльцевыми аллергенами	Нет, даже после концентрации антител	Есть, после концентрации антител	Преципитирующая активность не совпадает с гемагглютинирующей
Инактивация меркаптанами	Происходит	Не происходит	Нет данных
Расщепление папаином	Медленное		Нет данных
Константа седиментации	Больше 7(8-11)S
Электрофоретические свойства	Преимущественно γ1-глобулины	γ2-глобулины	Большая часть связана с γ2-глобулинами
Класс иммуноглобулинов

Библиография

Бернет Ф. Клеточная иммунология, пер. с англ., М., 1971; Гаурови ц Ф. Иммунохимия и биосинтез антител, пер. с англ., М., 1969, библиогр.; Доссе Ж. Иммуногематология, пер. с франц., М., 1959; Здродовский П. Ф. Проблемы инфекции, иммунитета и аллергии, М., 1969, библиогр.; Иммунохи-мический анализ, под ред. Л. А. Зильбера, с. 21, М., 1968; Кэбот Е. и Мейер М. Экспериментальная иммунохимия, пер. с англ., М., 1968, библиогр.; Незлин Р. С. Строение биосинтеза антител. М., 1972, библиогр.; Носсе л Г. Антитела и иммунитет, пер. с англ., М., 1973, библиогр.; Петров Р. В. Формы взаимодействия генетически различающихся клеток лимфоидных тканей (трехклеточная система иммуногенеза), Усп. совр. биол., т. 69, в. 2, с. 261, 1970; Утешев Б. С. и Бабичев В. А. Ингибиторы биосинтеза антител. М., 1974; Эфроимсон В. П. Иммуногенетика, М., 1971, библиогр.

Аллергические А. - Адо А. Д. Аллергия, Многотомн. руководство по пат. физиол., под ред. H. Н. Сиротинина, т. 1, с. 374, М., 1966, библиогр.; Адо А. Д. Общая аллергология, с. 127, М., 1970; Польнер А. А., Вермонт И. Е. иСерова Т. И. К вопросу об иммунологической природе реагинов при поллинозах, в кн.: Пробл. аллергол., под ред. А. Д. Адо и А. А. Подколзина, с. 157, М., 1971; Bloch К. J. The anaphylactic antibodies of mammals including man, Progr. Allergy, v. 10, p. 84, 1967, bibliogr.; Ishizaka K. a. Ishizaka T. The significance of immunoglobulin E in reaginic hypersensitivity, Ann. Allergy, v. 28, p. 189, 1970, bibliogr.; Lichtenstein L. М., Levy D. A. a. Ishizaka K. In vitro reversed anaphylaxis, characteristics of anti-IgE mediated histamine release, Immunology, v. 19, p. 831, 1970; Sehon A. H. Heterogeneity of antibodies in allergic sera, в кн.: Molec. a. celL basis of antibody formation, ed. by J. Sterzl, p. 227, Prague, 1965, bibliogr.; Stanworth D. R. Immunochemical mechanisms of immediate-type hypersensitivity reactions, Clin. exp. Immunol., У. 6, p. 1, 1970, bibliogr.

Моноклональные антитела - Гибридомы: новый уровень биологического анализа, под ред. Р. Г. Кеннета и др., М., 1983; Рохлин О. В. Моноклональные антитела в биотехнологии и медицине, в кн.: Биотехнология, под ред. А. А. Баева, с. 288, М., 1984; N о w i n s k i R. C. a. o. Monoclonal antibodies for diagnosis of infectious diseases in humans, Science, v. 219, p. 637, 1983; Ollson L. Monoclonal antibodies in clinical immunobiology, Derivation, potential and limitations, Allergy, v. 38, p. 145, 1983; Sinko vies J. G. a. D r e e s m a n G. R. Monoclonal antibodies of hybridomas, Rev. infect. Dis., v. 5, p. 9, 1983.

М. В. Земсков, H. В. Журавлева, В. М. Земсков; А. А. Польнер (алл.); А. К. Туманов (суд.); А. С. Новохатский (Моноклональные антитела).

Эмиль фон Беринг

Антиген - вещества, способные вызывать иммунный ответ, выработку антител.

Классификация по происхождению: естественные АГ, искусственные АГ; АГ, полученные в результате ГМ естественных АГ; синтетические АГ.

По химическому составу – это 1)белки. Минимум, 8 АК. Но всё, что меньше 20 АК вызывает иммунную реакцию с очень низкой вероятностью. 2)углеводы. 3)НК. 4) некоторые липиды – стероиды НП, холестерин, а вот триглицериды (сильно биполярные) – оч плохие АГ, к ним АТ не вырабатываются.

По отношениям пары донор-реципиент: 1) ауто-АГ (своего организма), 2)изо-АГ (от генетически-идентичной особи: клон или близнец), 3)алло-АГ (того же вида)вероятность такого контакта у взрослого человека в природных условиях крайне мала, встречается, например, при переливании крови. У колониальных асцидий – легко4)ксено-АГ(другого вида) – всё остальное! – мыши, коровы, вирусы, бактерии. Итого, самое интересно – это ауто- и ксено-АГ.

Антигенность – мера антигенного качества, способность вызывать большую или меньшую продукцию АТ.

Иммуногенность – это способность создавать состояние иммунитет, т.е.е невосприимчивости организма при повторном контакте с антигеном.

Самый яркий пример, когд а2 эти свойства не совпадают – это сальмонелла. Продукция АТ огромна, а вот иммунитет против неё не вырабатывается. +ИППП (инф, передающиеся половым путем).

Иммуногенность связана с наличием на поверхности АГ т.н. антигенных детерминант (=эпитопов).

Г-н Карл Ландштейнер (NP1930г). Опыт:

МАБС – метааминобензолсулфонат – вводили мышам – не было никакого эффекта.

МАБС сшили с белком овальбумуном – ввели мышам – получили два типа антител: к овальбумину и к МАБС.

Термины: «гаптен» и «носитель». Гаптен – маленькая группировка, с которой происходит связывание АТ, тут и возникло понятие эпитопа. Итак, чем больше размер и чем большую гетерогенность имеет молекула АГ, тем сильнее будет ответ. Т.е иммунный ответ вызывается не всей молекулой, а определенными группировкам на её поверхности.

Другой опыт Ландштейнера:

Пришивал боковые группировки в разные позиции МАБС (орто/мета/пара)

Мышь иимунизировали конъюгатом овальбумин-МАБС. А проявлял АТ, вводя разные вещества (см.таблицу). Самое сильное связывание – в мета-положении.

Показано, что АТ специфичны к очень маленькой группировке, которая достаточно точно соответствует структуре паратопа (АГ-распознающего участка). Так, размер этой группировки (эпитопа) оч небольшой. Разные участки одной молекулы могут выполнять функции и носителя, и гаптена.

Пространственные (или криптальные) АГ.

Молекулы Антител состоят из двух белковых цепей: тяжелой и легкой. Они относятся к фракции γ-глобулинов сыворотки крови.

Портер и Эдельман, 1960е. Определили АК, нуклеотидную последовательности. Построили модели с помощью рентгено-структурного анализа. Показали, что ИГ состоит из двух тяжелый Н и двух легкий цепей L. Цепи состоят из ИГ-доменов, внутри каждого домена альфа-спиральные бета-складчатые участки, и в каждом домене есть как минимум одна дисульфидная связь. Тяж и легкие цепи связаны двумя дисульфидными связями, а тяжелые цепи между собой связаны переменным числом дисульфидных связей. Место соединения Л и Т цепей – шарнирный участок.

Изменениям подвержены только вариабельные участки VHиVL.

Типы тяжелых цепей: (в порядке открытия)

γ-цепь – IgG(4 домена)

μ – IgM(5доменов)

α – IgA(4 домена)

δ – IgD(4 домена)

ε – IgE (5 домена)

Связывание компонентов С’ происходит между 2 и 3м доменами. С С2-доменом IgGсвязаны сайты гликозилирования – эта зона шарнирного участка прикрывается. Наличие углеводного компонента приводит к вариабельности массы различных антител с разницей до 30кДа.

Несколько конформаций структуры паратопа.

Pocket– распознавание пептидов, длиной максимум 7 АК, обычно = 3-5АК.

• Расширенная поверхность (например, распознавание лизоцима)

  Исходно все эти три модели были выведены математически – а позже подтверждены экспериментально.

(картинка)

CDR–Complementarydeterminedregion– участки, определяющие комплементарность – термин касается зоны соприкосновения с АГ. В пределахCDRмогут меняться разные кусочки. Так, на тяжелой цепи триCDR, на легкой – два. Т.е. меняется не весь антиген, а только эти участки (на уровне гена - гипермутации).

Современные теории образования антител можно разделить на две группы. Сторонники первой группы считают, что антиген, введенный в организм, непосредственно участвует в образовании антител. Это инструктивные теории . Классическим примером их является теория прямой матрицы Гауровитца - Полинга. Согласно этой теории, антиген проникает в клетку и служит там своеобразной матрицей, на поверхности которой, как на штампе, происходит пространственное конфигурирование гаммаглобулинов. Под влиянием антигена происходит изменение синтеза глобулинов, касающееся не формирования полипептидной цепи, а лишь второй фазы - стадии формирования молекулы, конфигурация которой меняется: концевые части образовавшейся молекулы точно соответствуют конфигурации детерминантной группы антигена. Данная теория не может правильно объяснить многие иммунологические феномены, в том числе и выработку иммуноглобулинов. Она не объясняет несоответствие между продолжительностью образования иммуноглобулинов и временем сохранения антигена в организме (антитела сохраняются годами после введения антигена, а он - ограниченный срок). С позиций данной теории невозможно объяснить феномены иммунологической памяти, иммунологической толерантности, эффективность вторичного иммунного ответа.

Вторая группа - селективные теории антителообразования. Теория «боковых цепей» П. Эрлих а, созданная в 1896 г. и имеющая лишь историческое значение, заслуживает внимания, так как в ней П. Эрлих впрвые высказал идею селекционирующей роли антигена. Клетка, синтезирующая антитела, не создает новых специфических структур под влиянием антигена, они в ней предсуществуют. П. Эрлих предполагал, что на поверхности клеток имеются разнообразные химические группировки - рецепторы, с которыми антиген вследствие химического сродства соединяется, блокирует их функции. В ответ на это клетки вырабатывают большое количество рецепторов, избыток которых обрывается и начинает циркулировать в крови в виде специфических антител.

В 1955 г. Иерне возродил теорию «боковых цепей», на основе которой создал свою теорию естественного отбора. Он высказал предположение, что антиген не является матрицей для синтеза антител и не вызывает генетических изменений в клетках - продуцентах антител, а роль его сводится лишь к селекции уже готовых «нормальных» антител, спонтанно возникающих к различным антигенам. Попав в организм, антиген находит соответствующее антитело, соединяется с ним, образовавшийся комплекс антиген - антитело поглощается фагоцитами и попадает в клетки, вырабатывающие антитела. Клетки начинают производить антитела данной специфичности.

Клональноселекционная теория Ф. Бернета (1959) является дальнейшим этапом развития теории Иерне. Согласно этой теории, в организме предсуществуют мезенхимные клетки, которые имеют на своей поверхности реактивные участки, соответствующие одному или определенному числу детерминант антигена (имеются клетки с рецепторами ко всем существующим антигенам). Антиген, попав во внутреннюю среду, селекционирует, вступает в контакт с клетками, имеющими соответствующий рецептор. Как следствие контакта происходят размножение селекционированной клетки (образуется клон) и стимуляция синтеза иммуноглобулинов, специфических для данного антигена.

Советский иммунолог П. Ф. Здродовский в 1966 г. предложил матричногенетическую теорию образования антител и регуляции этого процесса в целостном организме исходя из следующих известных положений: 1) продуцентами антител являются клетки ретикулолимфоидной ткани; 2) биосинтез иммуноглобулинов-частный случай биосинтеза белка, регулируемого соответствующими участками ДНК в хромосомах клеток; 3) антиген, введенный в организм, вызывает растормаживание генетических детерминант, ответственных за синтез активных центров антител и контролирующих размножение клеток - продуцентов иммуноглобулинов. В результате индуцируется выработка адренокортикотропного гормона (АКТГ) и других гормонов, принимающих участие в регуляции иммуногенеза.

Из современных представлений об иммунологическом процессе заслуживает внимания гипотеза, поддерживаемая видным советским иммунологом Р. В. Петровым. Установлено, что в развитии иммунного ответа организма на антиген участвуют три типа клеток: Т, Влимфоциты и макрофаги, между которыми устанавливается кооперированное взаимодействие. Антиген, попадая в организм, ассимилируется макрофагом, который его разрушает и формирует более активную, чем исходный антиген, детерминанту, выходящую на поверхность клетки. Макрофаг, имеющий такой комплекс.на поверхности, вступает в контакт (кооперирует) с Т и Влимфоцитами и передает им информацию осуществления иммуногенеза. Из Влимфоцитов возникает клон клеток, продуцирующих антитела заданной специфичности. Механизм кооперированного взаимодействия клеток иммунной системы окончательно не выяснен. Установлено, что не только контактные связи, но и выделяющиеся клетками гуморальные факторы имеют значение в иммуногенезе, что важно регулирующее влияние костного мозга, гипофизарноадреналовой системы организма.

Таким образом, поддержание иммунного гомеостаза, регуляция специфической защиты организма от чужеродных антигенов осуществляется сложно организованной иммунной системой, механизмы функционирования которой до конца еще не познаны.

Антитело - это молекула, без которой невозможно представить современную науку и медицину. Она играет ключевую роль как во многих методиках экспериментальной науки, так и при диагностике различных заболеваний. Лекарства на основе антител изменили облик фарминдустрии и продолжают будоражить мир всё новыми и новыми перспективами. Между тем, эта область знаний проделала сложный и увлекательный путь, в котором рука об руку шли фундаментальная и прикладная науки, над которой работали гениальные исследователи и где совершались воистину великие открытия. Мы расскажем об основных вехах изучения антител, а также об их применении в медицине и науке. Данная статья открывает цикл работ, посвященных моноклональным антителам.

Спецпроект об антителах, истории их изучения, методах работы с ними, а также о применении антител в современной медицине и биотехнологии.

Партнер спецпроекта - Департамент вычислительной биологии одной из крупнейших российских биотехнологических компаний - . BIOCAD заслужил серьезные позиции на мировом фармацевтическом рынке благодаря выпуску лекарственных препаратов на основе антител.

Глава 1. Краткая история открытия антител: от XIX века до наших дней

Начало: история разработки сыворотки против дифтерии

Ко второй половине XIX века в зарождающейся науке иммунологии накопилось достаточно данных об иммунизации - способности организма противостоять возбудителю заболевания при повторной встрече с ним. Знаковую роль здесь сыграла разработка Эдвардом Дженнером и широкое распространение первой эффективной вакцины против натуральной оспы в конце XVIII - начале XIX веков. Дженнер использовал содержимое пустул больных коровьей оспой, неопасной для людей, для получения иммунитета против натуральной оспы (рис. 1). Вкратце с этой историей можно познакомиться на сайте «История медицины ».

Со временем пришло понимание, что вещества иммунизированного организма, помогающие ему не заболеть при повторном контакте с возбудителем заболевания, содержатся в жидкой части крови - сыворотке . Сыворотку можно вводить в организм, никогда с возбудителем не контактировавший, и добиваться его защиты на некоторое время, а также вылечить уже больной организм!

В 1888 году Эмиль Ру и Александр Йерсен открыли растворимый токсин дифтерийной палочки . Иммунизация лабораторных животных данным токсином приводила к образованию вещества, обезвреживающего его - так называемого антитоксина, который составлял действующую основу сыворотки. Важным моментом стало понимание того, что иммунный ответ направлен не на микроорганизм в целом, а на его часть - будь то растворимое секретируемое вещество или элемент структуры. Позднее термин «токсин» сменился на более широкий термин «антиген », а «антитоксин» - на «антитело ».

В 1890 году вышел в свет совместный труд немецкого врача-исследователя Эмиля Адольфа фон Беринга (рис. 2) и японского исследователя-микробиолога Китасато Сибасабуро «О развитии иммунитета против дифтерии и столбняка у животных », в котором они показали, что сыворотка крови кроликов, инфицированных столбнячной палочкой , способна защитить мышей от живых столбнячных бацилл и столбнячного токсина. Через неделю Беринг опубликовал об аналогичных защитных свойствах сыворотки крови морских свинок, иммунизированных инактивированными возбудителями дифтерии и дифтерийным токсином. Свою работу Беринг завершил довольно громким заявлением: «Таким образом, возможность лечения даже самых тяжелых заболеваний больше не может быть проигнорирована» .

Приведенные выводы вызвали общественный резонанс. Столбняк - заболевание с контактным путем передачи и высокой летальностью - являлся в то время частой причиной смерти детей и военнослужащих (к слову, бóльшую обеспокоенность вызывало последнее, несмотря на факты и статистику). Вопрос дифтерии также стоял достаточно остро. Отсутствие эффективных методов ее лечения приводило к тому, что практически каждый двадцатый ребенок в Европе и США умирал от этой болезни.

В январе 1892 года Беринг начал первое исследование антидифтерийной сыворотки на людях. Старт был дан в рождественскую ночь 1891 года, когда маленькой умирающей девочке в хирургическом отделении Берлинского детского госпиталя Бергманна произвели первую инъекцию спасительной сыворотки.

Технология, однако, имела ограниченный потенциал для проведения больших исследований, повысить который Берингу удалось в сотрудничестве с Паулем Эрлихом . Для получения сыворотки ученые начали использовать вместо кроликов более крупных животных (лошадей), благодаря чему удавалось получать бóльшее количество сыворотки. Кроме того, методика иммунизации стандартизовали и, соответственно, она стала пригодной для проведения клинических исследований.

В первых крупных наблюдениях, опубликованных в 1894 году, приведены результаты по лечению «чудо-сывороткой» 220 детей, из которых выжили целых 77% - невиданная для тех лет цифра. Если лечение начиналось в первые два дня, то выживаемость стремилась к 100%, если же на шестой день - успех ожидался лишь в 50% случаев. Совершенствуя сыворотку, Берингу удалось снизить смертность до 1–5% в случае своевременной диагностики заболевания.

Беринг считал свою сыворотку абсолютно безвредной, но, к сожалению, это было не совсем так. В 1896 году здоровому ребенку, который имел контакт с домработницей, заболевшей дифтерией, с профилактической целью была введена сыворотка. В ответ на это у мальчика развился анафилактический шок , и ребенка спасти не удалось. Волей судьбы, отец мальчика оказался известным патологоанатомом, который позднее задокументировал этот первый летальный случай, связанный с введением сыворотки.

Для Беринга это самое начало пути - он будет трудиться не только над проблемой лечения дифтерии, но также достигнет значительных успехов в вопросах вакцинации. Проведя колоссальную работу по разработке препарата фактически «от идеи к пациенту», Беринг заложил основы проведения доклинических и клинических исследований препаратов такого рода (про то, как устроены современные клинические исследования, можно почитать в посвященном этому спецпроекте). Яркую и плодотворную деятельность Беринга в 1901 году отметили Нобелевской премией с формулировкой «за работу по сывороточной терапии, главным образом за её применение при лечении дифтерии, что открыло новые пути в медицинской науке и дало в руки врачей победоносное оружие против болезни и смерти » .

Середина: селективная теория «боковых цепей» Пауля Эрлиха

В 1896 г. Грубер и Дархэм открыли феномен агглютинации бактерий , а в 1897 г. Крауз описал реакцию преципитации (образования комплекса) между антигеном и антителом, что дало возможность качественно и количественно изучать реакцию «антиген-антитело». Этим занялся Пауль Эрлих , выдающийся немецкий ученый, врач, микробиолог, один из основоположников иммунологии и химиотерапии (рис. 3). Эрлих разработал принцип количественного определения антител и антигенов методом титрования, что сейчас является необходимым условием стандартизации, а также заложил основы понимания специфичности взаимодействия антиген-антитело. Кроме того, в своей работе 1897 года «Измерение активности дифтерийной сыворотки и её теоретические основы» Пауль Эрлих впервые озвучил гипотезу образования антител, получившую название теории «боковых цепей» (рис. 4) .

Эрлих полагал, что антитело - это особый вид молекул, расположенных в виде рецепторов («боковых цепей») на поверхности клеток. Боковые цепи благодаря своей особой конфигурации, комплементарной (то есть полностью соответствующей ей) молекуле антигена, способны взаимодействовать с ней по принципу «ключ-замок», причем необратимым способом. Это взаимодействие специфическое, а на поверхности клеток исходно существует некий репертуар таких «боковых цепей». Антиген же способен отбирать специфичные ему рецепторы, которые далее открепляются от поверхности клетки, циркулируют в крови в поиске «своего» антигена и в конечном счете инактивируют его.

Простая и лаконичная теория Эрлиха быстро была подхвачена научными кругами, надолго определив вектор иммунологической мысли. Тем не менее через пару десятилетий в ней обнаружили бреши. Неразрешенные вопросы в первую очередь касались специфичности образующихся антител, так как со временем обнаружили, что антитела вырабатываются не только против возбудителей заболеваний, но и против безвредных веществ, в том числе собственных молекул организма и даже небольших химических соединений.

Рисунок 4. Теория «боковых цепей». На иммунной клетке присутствует репертуар боковых цепей, с которыми взаимодействует токсин по принципу «ключ-замок». Данное взаимодействие приводит к синтезу большого количества боковых цепей определенной специфичности, которые открепляются от поверхности в виде растворимых боковых цепей, циркулируют по кровотоку и нейтрализуют токсин.

Большой вклад в изучение репертуара антигенов внес Карл Ландштейнер . В начале ХХ века он показал существование антител к собственным антигенам организма - белкам на поверхности эритроцитов - и таким образом открыл существование групп крови , за что был удостоен Нобелевской премии (1930) . А в 1923 году Карл Ландштейнер открыл гаптены - класс низкомолекулярных соединений, иммунный ответ на которые не вырабатывается. Если же такое соединение связывалось с собственными белками организма (например, альбумином в крови или рецепторами на поверхности клеток), то на подобный комплекс начинали образовываться антитела.

Выработки антител можно было достичь и к откровенно «искусственным» соединениям, встреча с которым в природе полностью исключена - так, Ландштейнер получил антитела к динитрофенилу. Стало понятно, что о предсуществовании хоть и разнообразного, но заведомо ограниченного репертуара антител не могло идти и речи. Интуитивно понятным становилось предположение, что живой организм способен каким-то образом «прочитывать» структуру антигена и далее синтезировать комплементарные ему антитела. Заметим, что структуру молекулы ДНК расшифровали лишь в 1953 году, а центральную догму молекулярной биологии «ДНК → РНК → белок» Фрэнсис Крик предложил только в 1958 году, поэтому развитие иммунологии до этого времени было заторможено незнанием принципа синтеза белковой молекулы. Считалось, что белки синтезируются на белковой матрице (что, конечно, оказалось совсем не так), и что уникальность матрицы определяет уникальность первичной структуры синтезируемого белка. Сходным образом должен был происходить и синтез антител, в процессе которого в качестве матрицы выступал антиген: антитела синтезировались прямо на его поверхности - аминокислоты сшивались в цепочку, комплементарную конформации антигена. Подобные представления о происхождении специфичности антител носили название матричных теорий .

Позднее получили данные, свидетельствующие в пользу того, что антитела имеют довольно схожую белковую природу. Компромисс был достигнут в теории Лайнуса Полинга и Дэна Кемпбелла. Они полагали, что до встречи с антигеном в организме синтезируются «протоантитела» в виде коротких белковых цепочек. После контакта с антигеном эти цепочки приобретают специфичность и далее сшиваются с помощью дисульфидных связей в двухвалентное антитело.

Конец: клонально-селекционная теория

Матричные теории ничего не говорили о продукции антител. Тем временем науке стали известны некоторые фенóмены, которые трудно объяснялись матричными теориями, такие как иммунологическая память (способность при повторном контакте с антигеном отвечать более быстрым, сильным и специфичным образованием антител) и иммунологическая толерантность (способности не реагировать на собственные антигены). Все эти феномены предполагали наличие более тонкого механизма, чем логичные и механистические матричные теории.

В 1948 году шведская исследовательница Астрид Фагреус показала, что источником антител являются активированные В-лимфоциты - плазматические клетки , а спустя год, в 1949 году, австралийский вирусолог Фрэнк Бёрнет (рис. 5) совместно с Фрэнком Феннером издал монографию «Продукция антител», где впервые выдвинул гипотезу непрямой матрицы . Согласно ей, антигены способны изменять структуру РНК (наиболее вероятную матрицу для синтеза белка) в антиген-продуцирующих клетках, что приводит к синтезу специфических антител. В теории было немало «белых пятен» - например, оставался абсолютно неясен механизм изменения структуры РНК.

Рисунок 7. Общая схема получения гибридомы. Из селезенки иммунизированной мыши выделяют антитело-продуцирующие клетки, которые сливают с клетками миеломы. В результате слияния образуются гибридомы, которые культивируют в специальной среде для селекции клеток гибридом, продуцирующих антитела.

Технологию производства гибридом, синтезирующих моноклональные антитела, разработали Сезар Мильштейн и Жорж Келер (рис. 8) в 1970-х годах. О том, как это происходит, можно прочитать в статье Гарри Израилевича Абелева «Моноклональные антитела» .

Технология получения гибридом не была запатентована, и метод беспрепятственно и быстро распространился по многим лабораториям мира, катализировав развитие иммунологической отрасли. Метод гибридом положил начало целому семейству иммунологических технологий, о которых мы рассказывали в статье «Иммунологические технологии » спецпроекта « » . К слову, это был не просто отказ от патентования, а оплошность, причем с довольно громкими, в том числе и политическими, последствиями.

В то время в Великобритании поиском потенциальных биомедицинских продуктов для патентования занималась организация Medical Research Council (MRC ), при этом не имеющая права патентовать сама; патентованием заведовала другая организация - National Research Development Corporation (NRDC ).

В июле 1975 года Тони Викерс, агент MRC, приметил крайне заманчивую для коммерциализации технологию Мильштейна и попросил последнего отправить ему неопубликованный вариант статьи с описанием метода, в это время ожидавшей рецензии в журнале Nature . Викерс немедленно передал заявку в NRDC с вопросом о возможности получения патента, однако организация ничего не ответила. В августе 1975 г. в Nature вышла статья Мильштейна и Келера , и лишь в октябре 1976 года NRDC удостоила авторов ответом, в котором говорилось, что методика получения гибридом не может быть запатентована, так как была ранее опубликована в научном журнале.

Неспособность NRDC запатентовать технику Келера и Мильштейна стала предметом крупных споров в конце 1970-х годов. Подлила масла в огонь непростая экономико-политическая обстановка в Великобритании. Одним из самых яростных критиков отказа патентной организации стала Маргарет Тэтчер , химик по образованию, избранная премьер-министром в 1979 году. Гнев «железной леди» был многократно усилен известием о патентовании Хилари Копровски (главы американской компании «Вистар»), Карло Кроче и Вальтером Герхардом моноклональных антител против опухолевых антигенов, а позднее - антител против антигенов вируса гриппа. Это были первые патенты на технологию получения моноклональных антител. Не радовал английское правительство и тот факт, что в патентах компании «Вистар» моноклональные антитела были созданы с использованием линии клеток миеломы X63, которую в сентябре 1976 года Хилари Копровски предоставил сам Мильштейн.

Предоставление линии клеток соответствовало традиции многих ученых того времени. Немногочисленные требования к адресатам заключались лишь в том, чтобы они указывали в публикациях источник культур, спрашивали разрешение в том случае, если собирались передавать культуру третьим лицам, и отказывались патентовать какие-либо продукты, получаемые из культур этих клеток. И, как показала практика, в особенности последнее требование оказалось трудно выполнимо потому, что не было оформлено юридически.

Так или иначе, Мильштейн не испытывал горьких разочарований и однажды сказал докучавшему его журналисту: «Нет, я не был несчастен, Маргарет Тэтчер - была» . Как и многие ученые того времени, Мильштейн рассматривал патентование со здоровой долей брезгливости и считал, что исполнил свой долг, отправив неопубликованную статью Викерсу в июле 1975 года. Позднее Мильштейн признался, что отсутствие патента было благословением, которое помогло ему плодотворно и свободно трудиться и делиться своими научными результатами. Как настоящий ученый, Мильштейн предпочитал не думать о том, что наличие патента сделало бы его миллионером. А в 1984 году труды Келера и Мильштейна отметили Нобелевской премией с формулировкой «за открытие и разработку принципов выработки моноклональных антител с помощью гибридом » .

Глава 3. Антитела на страже здоровья: применение в лабораторной и медицинской диагностике

Более века врачи и ученые работали над тем, чтобы сделать из антител «магическую пулю» - высокочувствительный, точный и эффективный препарат для лечения пациентов. Осуществлению этой мечты способствовало открытие и получение моноклональных антител, которые точечно взаимодействуют с заданным антигеном. Некоторые препараты на основе моноклональных антител смогли стать настоящим золотым стандартом лечения.

Однако лечение - не единственное, для чего моноклональные антитела могут использоваться на практике. Сегодня существует множество биодиагностических методов, использующих в качестве инструмента моноклональные антитела.

Проточная цитофлуориметрия

Проточная цитометрия - важная методика, которая позволяет получать комплексную информацию о множестве клеток за раз. С помощью этого метода можно узнать размер клетки, содержание ДНК или РНК и многие другие параметры. И если в прошлом проточные цитометры себе могли позволить только крупные академические центры, то сейчас такое оборудование есть уже во многих больницах общего профиля. Современные проточные цитометры стали намного меньше, дешевле и удобнее в использовании. «Биомолекула» подробно рассказывала об этой технологии в статье «Проточная цитофлуориметрия » спецпроекта «12 биологических методов в картинках » .

Немного объясним суть методики. Суспензия клеток предварительно метится моноклональными антителами, сшитыми со светящейся меткой, и помещается в поток жидкости, пропускаемый через проточную ячейку. Исследуемые клетки выстраиваются в цепочку и в таком порядке пересекают пучок световых (обычно лазерных) лучей, служащих для анализа каждой отдельно взятой клетки. Исходящий свет фокусируют при помощи оптической системы, а затем раскладывают на определенные компоненты. Полученные световые сигналы преобразуют в электрические импульсы и анализируют при помощи специального программного обеспечения. Таким образом, результат цитометрического анализа - определение состояния каждой клетки в образце с возможностью разделить образец на популяции клеток.

Спектр применения данной методики необычайно широк: ее используют в иммунологии, онкологии, цитологии, гематологии, фармакологии, сельском хозяйстве. В 1990-х годах, благодаря этому методу, осуществили сортировку индивидуальных хромосом, тетраном (гибридных гибридом, которые производят бифункциональные антитела) и др. Огромный толчок развитию проточной цитометрии дало открытие гибридомной технологии и, как следствие, получение моноклональных антител к большому количеству антигенов как на поверхности клеток, так и в цитоплазме. Большинство клинических применений проточной цитометрии осуществляется именно с помощью моноклональных антител. Так, получены коммерчески доступные антитела, которые позволяют определять поверхностные антигены лейкоцитов человека. Такие моноклональные антитела применяют для определения опухолей, лейкемий, диагностирования различных аутоиммунных заболеваний, исследования активации клеток иммунной системы: лимфоцитов, натуральных киллеров, моноцитов/макрофагов и др. .

Также важным шагом для изучения клеток стало получение моноклональных антител к различным фосфоэпитопам, поскольку информация о фосфорилировании белка нередко позволяет установить его функцию. Впервые фосфорилин-зависимые поликлональные антитела получили в 1981 году. Сейчас же наличие аналогичных, но моноклональных антител обеспечивает более эффективное изучение функционирования клеток. Также сейчас коммерчески доступны антитела, меченные различными флуоресцентными белками. Это позволяет исследователю использовать их таким образом, чтобы на меньшем объёме образцов получать о них максимальную информацию.

Иммуногистохимия

Еще одним важным диагностическим методом, в котором используются моноклональные антитела, является иммуногистохимия. На всех тканях, в том числе и опухолевых, содержатся молекулы, служащие мáркерами той или иной ткани или популяции клеток. Окрашивание среза ткани моноклональными антителами позволяет определить тип опухоли и подобрать необходимое лечение. Так же, как и в случае проточной цитометрии, метод гибридом позволил исследователям получить моноклональные антитела к различным тканевым и опухолеассоциированным антигенам, что способствовало широкому распространению метода иммуногистохимии. В XX веке иммуногистохимический анализ стали применять в диагностике онкологических заболеваний. Сегодня такой анализ зачастую является обязательным для подтверждения первичного диагноза, особенно если лечение требует использования дорогостоящих лекарств. И хотя иммуногистохимия существует около 50 лет, до сих пор данную процедуру довольно сложно стандартизировать. Поэтому крайне важным в этой методике является использование моноклональных антител, которые обладают низкой вероятностью перекрестного взаимодействия с другими белками и возникновения неспецифических сигналов.

Глава 4. Фармацевтическая «аллея славы»: как антитела заняли лидирующие позиции на рынке лекарственных препаратов

В 1985 году, спустя всего лишь год после вручения Келеру и Мильштейну Нобелевской премии за разработку методики получения моноклональных антител, FDA одобрило самое первое лекарство на основе мышиного моноклонального антитела - муромонаб , или OKT3 . Свое название оно получило от сокращения его изначального длинного названия - MURine MONoclonal AntiBody targeting CD3 , что переводится как «мышиное моноклональное антитело, распознающее CD3». Антитело взаимодействовало с особой молекулой CD3 на поверхности T-лимфоцитов, которая важна в том числе и для развития реакции отторжения трансплантированного органа (например, почки). Соответственно, блокируя CD3, можно добиться лучшего приживания органа в организме реципиента. Однако впоследствие у этого препарата выявилось множество побочных эффектов, которые были вызваны ответом иммунной системы пациента на чужеродные мышиные белки, поступающие в организм человека вместе с препаратом . Поэтому следующим шагом стало получение моноклональных антител с сохранением наименьшего количества чужеродного для человека мышиного материала в препарате.

Сейчас практически все препараты основаны на так называемых химерных или гуманизированных антителах. В химерных антителах участки, которые непосредственно распознают антиген, имеют мышиное происхождение, а остальная (и бóльшая) часть антитела - человеческое. А в гуманизированных антителах доля мышиного материала еще меньше, и поэтому они еще реже вызывают негативные реакции со стороны организма пациента.

Помимо моноклональных, существуют также и другие типы антител . Рассмотрим их поподробнее.

Лидирующие позиции на рынке пока остаются за классическими моноклональными антителами . По данным 2014 года, из 47 препаратов на основе моноклональных антител, одобренных и продаваемых на тот момент в США и Европе, 31 является полноразмерным моноклональным антителом . Один препарат - это биспецифическое антитело, три - конъюгированные антитела, три - Fab-антитела и девять - Fc-слитые белки (табл. 1). Скорее всего, связано это с тем, что оптимизировать получение и функционирование генетически инженерных конструктов довольно сложно, хотя с каждым годом количество таких препаратов продолжает увеличиваться.

В последние годы темпы развития рынка моноклональных антител непрерывно растут. В 2015 году глобальный доход от продаж таких препаратов составил чуть менее $90 млрд - это почти 60% от общего объема продаж всех биофармацевтических продуктов. При этом шесть из десяти самых продаваемых биофармацевтических продуктов в 2015 году оказались моноклональными антителами .

Известно, что по состоянию на 31 октября 2016 года на рынках США и Европы существует уже 71 препарат на основе моноклональных антител . Также в 2010 году одобрили 10 новых препаратов для использования на территориях США и Европы. По состоянию на 1 декабря 2017 года девять терапевтических моноклональных антител проходят регуляционные тестирования, и сведения об их использовании станут известны в конце 2018 года. Также в конце 2018 года представят заявки на получение торговой лицензии еще 12 новых препаратов, из которых четыре предназначаются для лечения онкологических заболеваний.

Humira , Remicade , Enbrel , Rituxan , Avastin и Herceptin являются шестью самыми продаваемыми препаратами на основе моноклональных антител (рис. 9). Расскажем поподробнее про каждый из них.

Рисунок 9. Динамика продаж коммерческих препаратов моноклональных антител. Сравнение уровня продаж препаратов шести моноклональных антител по сравнению с препаратами рекомбинантных белков Avonex и Rebif в период с 2006 по 2015 год. В 2016 году доход от продажи каждого из шести препаратов превышал $6,5 млрд.

«Хумира» (адалимумаб) - это антитело, которое связывается с молекулой фактора некроза опухолей (TNF) и таким образом уменьшает воспаление. Препарат используют для лечения ревматоидного артрита , псориаза , болезни Крона и других аутоиммунных заболеваний. В 2015 году объемы продаж этого препарата составили $14 млрд, что сделало его самым продаваемым лекарством. «Ремикейд» (инфликсимаб) и «Энбрель» (этанерцепт ) - также препараты на основе антител, связывающихся с молекулой TNFα. Ввиду того, что эти препараты вышли на рынок несколько позже Humira, их объемы продаж несколько меньше: около $8 млрд каждого. «Ритуксан» (ритуксимаб) - антитело, связывающееся с белком CD20, который экспрессируется только на поверхности В-клеток. Кроме того, более 90% В-клеточных неходжкинских лимфом также экспрессируют CD20. Препарат буквально убивает бóльшую часть В-лимфоцитов. Казалось бы, это чрезвычайно вредно для организма, ведь В-лимфоциты - важные игроки иммунной защиты. Однако не стоит забывать, что бóльшая часть В-клеток в крови пациентов - это опухолевые клетки. Избавляясь от них, мы даем организму шанс начать производить новые здоровые клетки, и уже через 12 месяцев уровень В-лимфоцитов полностью восстанавливается.

Классические методы лечения неходжкинской лимфомы, такие как химиотерапия и радиационная терапия, обладают высокой токсичностью, а также низкопецифичны в отношении опухоли, так как уничтожают большое количество здоровых клеток. Тогда как терапия антителами более избирательна и менее разрушительна для организма . Получение ритуксимаба, менее агрессивного и более щадящего препарата, стало важной вехой развития медицины и позволило вывести лечение онкологических пациентов на качественно новый уровень. Именно поэтому в 1997 году ритуксимаб одобрили для лечения B-клеточной неходжкинской лимфомы, а в 2010 - в качестве поддерживающей терапии после первичного лечения фолликулярной лимфомы. Ритуксимаб находится в перечне основных лекарственных средств ВОЗ, в списке наиболее важных лекарств, необходимых в базовой системе здравоохранения. Для некоторых заболеваний (таких как гранулематоз с полиангитом и микроскопический полиангит) лечение ритуксимабом является единственным одобренным FDA. Ритуксимаб также активно используется в лечении ревматоидного артрита в комбинации с метотрексатом, что у половины пациентов приводит к улучшению симптомов в течение полугода. Если же пациенты принимают только метотрексат, то улучшение наблюдается лишь у 18%. «Авастин» (бевацизумаб) - моноклональное антитело, блокирующее работу эндотелиального фактора роста A (VEGF-A). В 1989 году Наполеон Феррара, молекулярный биолог, работавший в лаборатории корпорации Genentech, обнаружил молекулу VEGF (Vascular endothelial growth factor ) - белок, который способствует росту сети кровеносных сосудов (ангиогенезу ). В 1993 году Феррара показал, что блокирование работы VEGF специфическими моноклональными антителами приводит к резкому замедлению роста различных опухолей. Его исследования подтверждали ранее предложенную гипотезу Иуды Фолькмана, в которой говорилось, что остановка ангиогенеза может быть эффективным путем борьбы с опухолями, поскольку они начинают получать меньше питательных веществ и погибают. Стало понятно, что необходимо получить препарат, который будет блокировать молекулу VEGF. Это привело бы к ингибированию разрастания сети кровеносных сосудов вокруг опухоли, и та, не получая достаточного кровоснабжения, перестанет расти и метастазировать.

И вот, интенсивная работа исследователей принесла свои плоды - было получено несколько моноклональных антител, распознающих фактор VEGF-A. Каждое из этих антител связывалось с различными участками, или, говоря научным языком, эпитопами, молекулы VEGF-A , . Но лишь одно антитело оказалось способным распознавать и нейтрализовывать все изоформы этой молекулы. На его основе и был разработан препарат бевацизумаб - первый клинически используемый ингибитор роста кровеносных сосудов. Важность и революционность данного препарата заключается в том, что до его получения не существовало лекарств, нацеленных на прямую борьбу с ангиогенезом. В 1997 году начали проводить первые клинические испытания «Авастина» (торговое название бевацизумаба), а в 2004 году в США было получено одобрение для использования этого препарата в комбинированной терапии по лечению метастатического рака толстой кишки.

Позже «Авастин» стали использовать для лечения и других опухолей. Добавление его к стандартной химиотерапии 5-фторурацилом увеличивает продолжительность жизни пациентов. Также применение «Авастина» совместно с 5-фторурацилом существенно удлиняет промежуток времени, в течение которого опухоль увеличивается до первоначальных размеров. И, самое главное, «Авастин» совместно со стандартной химиотерапией уменьшает размеры самой опухоли: 45% против 35%. «Герцептин» (трастузумаб) - это антитело, которое связывается с молекулой Her2/neu и блокирует ее. Если Her2/neu присутствует на клетках в избыточном количестве, это зачастую приводит к развитию рака молочной железы.

Возникает закономерный вопрос - почему рынок моноклональных антител столь популярен и быстро развивается? Дело в том, что сейчас антитела - одни из самых удобных и эффективных инструментов для решения различных биомедицинских проблем. Антитела, как правило, хорошо переносятся организмом человека и обладают высокой специфичностью к антигену, что снижает риск неожиданных осложнений в клинических испытаниях. Зачастую для многих фармацевтических задач моноклональные антитела являются первыми кандидатами на получение продукта, который можно относительно быстро проверить в клинических испытаниях. Если предварительные исследования клинической эффективности успешны, то такой инновационный препарат можно быстро коммерциализировать и вывести на рынок.

Также в целом происходит глобальный рост фармацевтического рынка, глобальный рост населения, а в странах с развитой экономикой наблюдается повышение уровня жизни - все эти факторы обеспечивают повышенный спрос на новые биопрепараты. В современных условиях существует запрос на получение большого количества относительно недорогих в производстве противоревматоидных и противоастматических средств, и с этой задачей как нельзя лучше могут справиться моноклональные антитела. С каждым годом биофармацевтическая промышленность растет и развивается, при этом появляется всё больше возможностей для облегчения и корректировки течения многих заболеваний, в том числе при помощи моноклональных антител.

В России самой успешной компанией, занимающейся производством и выпуском препаратов на основе моноклональных антител, является . Уже сейчас компания выпускает около 20 лекарственных препаратов , предназначенных для лечения различных злокачественных опухолей, среди которых есть аналоги трастузумаба и бевацизумаба. Более 40 препаратов находится на стадии разработки, два из них планируют зарегистрировать в 2018 году (один из препаратов будет биоаналогом самого продаваемого aдалимумаба). BIOCAD первой из российских компаний стал лидером продаж препаратов, предназначенных для терапии онкологических заболеваний. По данным аудита фармацевтического рынка России, проводимого аналитической компанией IMS Health за январь–декабрь 2017 года, биотехнологическая компания BIOCAD второй год подряд удерживает лидерство в сегменте бюджетных закупок в рублях в конечных ценах (учитывались сведения по всем препаратам), а также впервые возглавила рейтинг поставщиков в сегменте государственных закупок противоопухолевых препаратов как в рамках программы 7ВЗН, так и вне ее.

7ВЗН - это программа «Семь высокозатратных нозологий», которая обеспечивает лекарствами людей с редкими заболеваниям. Доля BIOCAD в госзакупках лекарственных средств в 2017 году составила 4,2% при выручке 15,66 млрд рублей. В тройку лидеров вошли также NOVARTIS и Sanofi-Aventis с показателями 3,5% и 3,2%, соответственно. Список замыкает АО «Генериум» , вторая российская компания, попавшая в топ-10 фармацевтических компаний, поставщиков лекарственных средств в государственные лечебные учреждения. В сегменте противоопухолевых препаратов BIOCAD удерживает 14,2% без учета 7ВЗН и 18,9% с учетом программы.

Итак, теперь мы знаем, что моноклональные антитела - это настоящая «магия» во флаконе. Без них было бы сложно, а иногда и невозможно, вылечить или улучшить течение множества заболеваний, в том числе онкологических и аутоиммунных. Прошло примерно 50 лет с момента разработки технологии гибридом, и за это время было получено большое количество жизненно важных препаратов. Огромный спрос на моноклональные антитела показывает, насколько востребованными и эффективными являются эти лекарства. В последующих статьях цикла будет рассказано, как биотехнологи «улучшают» работу моноклональных антител, какие из современных препаратов созданы на их основе и как работает BIOCAD - успешная отечественная компания по разработке и производству моноклональных антител.

Таблица 1. Препараты на основе моноклональных антител, доступные в продаже (2014 год)

Название, торговая марка и год регистрации	Вид антитела	Компания / выпускающие компании в США и Европе	Глобальные продажи на 2013 год («–» - продукт зарегистрирован в конце 2013–2014 годах), млн $	Мишень	Показания
Раксибакумаб («Абтракс»), 2012	Моноклональное	Human Genome Sciences / Glaxo Smith Kline (США)	23	Токсины B. anthracis	Ингаляционная форма сибирской язвы
Тоцилизумаб («Актемра»), 2009	Моноклональное	Roche / та же (США, Европа)	1,119	IL-6R
Брентуксимаб ведотин («Адцетрис»), 2011	Конъгированное	Seattle Genetics / та же (США)/Takeda Pharmaceutical Co.(Европа)	253	CD30	Лимфома Ходжкина, анапластическая крупноклеточная лимфома
Фактор IX Fc-слитый белок, («Алпроликс»), 2014	Fc-слитый белок	Biogen Idec. / та же (США)	–	Фактор IX	Гемофилия типа B
Рилонацепт («Аркалист»), 2008	Fc-слитый белок	Regeneron Pharmaceuticals / та же (США)	17	Fc-IL1R	Семейный холодовой аутовоспалительный синдром, синдром Макла-Уэльса
Офатумумаб , («Арзерра»), 2009	Моноклональное	GlaxoSmithKline / та же (США, Европа)	117	CD20	Хронический лимфоцитарный лейкоз
Бевацизумаб , («Авастин»), 2004	Моноклональное		6,748	VEGF	Метастатический колоректальный рак, рак молочной железы, неплоскоклеточный немелкоклеточный рак легкого, почечно-клеточный рак, глиобластома, эпителиальный рак яичника, маточной трубы и первичный рак брюшины
Белимумаб , («Бенлиста»), 2011	Моноклональное	Human Genome Sciences / GlaxoSmithKline (США, Европа)	228	BLyS	Системная красная волчанка
Цертолизумаб пэгол («Симзия»), 2008	Fab-конъюгат	UCB / та же (США, Европа)	789	TNFα	Ревматоидный артрит, болезнь Крона, аксиальный спондилоартрит, псориатическая и энтеропатическая артропатия
Рамуцирумаб («Сирамза»), 2014	Моноклональное	Eli Lilly and Co. / та же (США)	–	VEGFR2	Рак желудка, немелкоклеточный рак легких, колоректальный рак
Фактор VIII Fc-слитый белок («Элоктат»), 2014	Fc-слитый белок	Biogen Idec / та же (США)	–	Фактор VIII	Гемофилия типа A
Этанерцепт («Энбрел»), 1998	Fc-слитый белок	Immunex / Amgen (США) и Pfizer (Европа)	8,325	TNFα	Ревматоидный артрит, ювенильный идиопатический артрит, псориатический артрит, аксиальная форма спондилоартрита, псориаз
Ведолизумаб («Энтивио»), 2014	Моноклональное	Takeda Pharmaceutical Co. / та же (США, Европа)	–	α4β7-интегрин	Язвенный колит, болезнь Крона
Цетуксимаб («Эрбитукс»), 2004	Моноклональное	ImClone Systems / Bristol-Myers Squibb (США) и Merck KGaA (Европа)	1,926	EGFR	Метастатический колоректальный рак, плоскоклеточный рак головы и шеи
Афлиберцеп т («Эйлеа»), 2011	Fc-слитый белок	Regeneron Pharmaceuticals / та же (США) и Bayer Healthcare Pharmaceuticals (Европа)	1,851	VEGF-A	Окклюзии сосудов сетчатки, дегенерация макулы, диабетическая ретинопатия
Обинутузумаб («Газива»), 2013	Моноклональное	Genentech / Roche (США, Европа)	3	CD20	Хронический лимфолейкоз, фолликулярная лимфома
Трастузумаб («Герцептин»), 1998	Моноклональное	Genentech / Roche (США, Европа)	6,559	Her2/neu	Рак молочной железы
Адалимумаб («Хумира»), 2002	Моноклональное	Abbott Laboratories / AbbVie (США, Европа)	10,659	TNFα	Ревматоидный артрит, ювенильный идиопатический артрит, псориатический артрит, активный анкилозирующий спондилит, псориаз, язвенный колит, болезнь Крона, гнойный гидраденит
Канакинумаб («Иларис»), 2009	Моноклональное		119	IL-1β	Острый подагрический артрит, cемейный холодовой аутовоспалительный синдром, cиндром Макла-Уэльса, младенческое мультисистемное воспалительное заболевание
Инфликсимаб («Инфлектра»), 2013	Моноклональное	Hospira / та же (Европа)	<1	TNFα	Ревматоидный артрит, псориатический артрит, болезнь Крона
Трастузумаб эмтанзин («Кадсила»), 2013	Конъюгированное	Genentech / Roche (США, Европа)	252	HER2	Метастатический рак молочной железы
Пембролизумаб («Kитруда»), 2014	Моноклональное	Merck & Co. / та же (США)	–	PD-1	Неопераблельная метастатическая меланома, немелкоклеточный рак легких
Алемтузумаб («Лемтрада»), 2013	Моноклональное	Genzyme Therapeutics / Sanofi (Европа)	3	CD52	Хронический лимфолейкоз
Ранибизумаб («Луцентис»), 2006	Fab-фрагмент антитела	Genentech / Roche (США) и Novartis Pharmaceuticals (Европа)	4,205	VEGF	Неоваскулярная форма возрастной макулярной дегенерации, диабетический отек макулы, патологическая миопия, диабетическая ретинопатия
Ромиплостим («Энплейт»), 2008	Fc-слитый белок	Amgen / та же (США, Европа)	427	Рецептор тромбопоэтина cMpl	Хроническая идиопатическая (иммунная) тромбоцитопеническая пурпура
Белатацепт («Нулоджикс»), 2011	Fc-слитый белок		26	CD80 и CD86
Абатацепт («Оренсия»), 2005	Fc-слитый белок	Bristol-Myers Squibb / та же (США, Европа)	1,444	CTLA4	Ревматоидный артрит, ювенильный идиопатический артрит
Пертузумаб («Перьета»), 2012	Моноклональное	Genentech / Roche (США, Европа)	352	HER2	Метастатический или местно-рецидивирующий неоперабельный рак молочной железы
Деносумаб («Пролиа»), 2011	Моноклональное	Amgen / та же (США) и GlaxoSmithKline (Европа)	824	RANKL	Постменопаузный остеопороз, потеря костной массы у женщин, получающих терапию ингибиторами ароматазы по поводу рака молочной железы, и у мужчин с раком предстательной железы, получающих гормон-депривационную терапию
Инфликсимаб («Ремикейд»), 1998	Моноклональное	Centoco / Johnson & Johnson (США) и Merck & Co. (Европа)	8,944	TNFα
Катумаксомаб («Ремоваб»), 2009	Биспецифическое	Fresenius Biotech / NeoPharm Group (Европа)	5	EpCAM и CD3	Карциноматозный асцит
Инфликсимаб («Ремисима»), 2013	Моноклональное	Celltrion / та же (Европа)	<1	TNFα	Ревматоидный артрит, болезнь Крона, язвенный колит, анкилозирующий спондилит, псориатический артрит, псориаз
Абциксимаб («РеоПро»), 1994	Fab-фрагмент антитела	Centocor / Lilly (США)	127	Гликопротеиновый рецептор типа IIb/IIIa тромбоцитов	Профилактика ишемии миокарда у больных группы повышенного риска, которым планируется проведение чрескожной коронарной баллонной ангиопластики, имплантация стента или атерэктомия
Ритуксимаб («Ритуксан»), 1997	Моноклональное	Genentech / Roche (США, Европа)	7,500	CD20	B-клеточные неходжкинские лимфомы
Голимумаб («Симпони»), 2009	Моноклональное	Centocor Ortho Biotech / Johnson & Johnson (США) и Merck & Co (Европа)	1,432	TNFα	Ревматоидный артрит, анкилозирующий спондилит, псориатический артрит
Базиликсимаб («Симулект»), 1998	Моноклональное	Novartis Pharmaceuticals / та же (США, Европа)	30	CD25	Профилактика отторжения трансплантата после пересадки почки
Экулизумаб («Солирис»), 2007	Моноклональное	Alexion Pharmaceuticals / та же (США, Европа)	1,551	C5-компонент комплемента	Пароксизмальная ночная гемоглобинурия
Устекинумаб («Стелара»), 2009	Моноклональное	Janssen-Cilag International / Johnson & Johnson (США, Европа)	1,504	IL12 и IL23	Бляшечный псориаз, псориатический артрит
Силтуксимаб («Силвант»), 2014	Моноклональное	Janssen Biotech / Johnson & Johnson (США, Европа)	–	IL-6	Болезнь Кастлемена
Паливизумаб («Синагис»), 1998	Моноклональное	Abbott Laboratories / AstraZeneca (США) и Abbvie (Европа)	1,887	Белок F респираторного синцитиального вируса	Профилактика тяжелой инфекции нижних дыхательных путей, вызванной респираторным синцитиальным вирусом
Натализумаб («Тизабри»), 2004	Моноклональное	Biogen Idec / та же (США, Европа)	1,527	Интегрин	Рассеянный склероз
Панитумумаб («Вектибикс»), 2006	Моноклональное	Amgen / та же (США, Европа)	389	EGF	Метастатический колоректальный рак
Деносумаб («Иксгева»), 2010	Моноклональное	Amgen / та же (США, Европа)	1,030	RANKL	Профилактика симптомов, связанных с патологией костной ткани у взрослых пациентов с метастазами солидных опухолей в костную ткань.
Омализумаб («Ксолар»), 2003	Моноклональное	Genentech / Roche (США) и Novartis (Европа)	1,465	FcεRI-рецептор	Атопическая бронхиальная астма, хроническая идиопатическаяй крапивница
Ипилимумаб («Ервой»), 2011	Моноклональное	Bristol-Myers Squibb / та же (США, Европа)	960	CTLA-4	Неоперабельная или метастатическая меланома
Афлиберцепт («Залтрап»), 2012	Fc-слитый белок	Sanofi Aventis / Sanofi (США, Европа)	70	VEGF	Метастатический колоректальный рак, возрастная влажная макулярная дегенерация
Ибритумомаб («Зевалин»), 2002	Конъюгированное	IDEC Pharmaceuticals / Spectrum Pharmaceuticals (США, Европа)	29	CD20	В-клеточная неходжкинская лимфома, фолликулярная лимфома

Департамент вычислительной биологии компании BIOCAD - спонсор спецпроекта

Одна из крупных международных биотехнологических компаний в России, объединившая научно-исследовательские центры мирового уровня, современное фармацевтическое и биотехнологическое производство, проведение доклинических и клинических исследований препаратов, соответствующих международным стандартам. В компании реализован полный цикл выпуска лекарственных препаратов: от поиска лекарственной молекулы до массового производства и маркетинговой поддержки. Разрабатываемые препараты применяют в лечении таких сложных заболеваний как рак, рассеянный склероз, ВИЧ и т.д.

В компании верят в предиктивную силу биологии и считают математическое моделирование основой для развития биотехнологий сегодня. То, что раньше было возможно осуществить исключительно in vitro в стенах лабораторий, сегодня может быть воплощено in silico силой чистого разума. Здесь собрали одну из лучших команд биоинформатиков в стране, которая занимается научными исследованиями, разрабатывает и внедряет новейшие методы интеллектуального анализа данных. В ее распоряжении один из мощнейших вычислительных кластеров, и если еще 2–3 года назад можно было только мечтать о решении задач направленного дизайна белковых молекул, то сейчас это одно из направлений работ Департамента вычислительной биологии.

Нам кажется, что в рамках совместного с «Биомолекулой» спецпроекта читателям будет интересно познакомиться с нюансами гуманизации антител и процессом поиска мишеней под конкретную нозологию.

Вполне возможно, вы уже знаете, что на основании ретроспективного анализа большинства известных моноклональных препаратов наша компания сформулировала современные требования к непатентуемым коммерческим наименованиям, которые были рассмотрены и приняты на заседании ВОЗ.

Раскрывая эту тему, постараемся описать различные виды антител и их уникальных vhh-представителей, коснуться вопроса иммуногенности и уже через него выйти к теме необходимости/желательности гуманизации. А также рассказать о пространственной структуре антител и о том, какие сложности с сохранением структуры поджидают исследователей при внесении мутаций.

Материал предоставлен партнёром - Департаментом вычислительной биологии компании BIOCAD

Литература

1. Первый «медицинский нобель» ;
2. Zielinska E. (2013). Side-chain theory, circa 1900 ;. . ;
3. Dotan E., Aggarwal C., Smith M.R. (2010). Impact of Rituximab (Rituxan) on the treatment of B-cell non-Hodgkin"s lymphoma . P. T. 35 , 148–157;
4. Domenico Ribatti. (2011). From the discovery of Vascular Endothelial Growth Factor to the introduction of Avastin in clinical trials - an interview with Napoleone Ferrara . Int. J. Dev. Biol. . 55 , 383-388.