Методы получения изолированных колоний. Физиология микроорганизмов: культуральные свойства бактерий, выделение чистых культур микроорганизмов

Питательные среды для культивирования бактерий

Для выделения чистых культур патогенных бактерий применяют оптимальные для их роста питательные среды с фиксированным рН. Большинство бактерий способно расти на различных питательных средах; исключение составляют хламидии и риккетсии, не растущие in vitro вне клеточных культур. Используемая среда должна содержать

Вещества, утилизируемые бактериями для различных биосинтетических процессов.

Универсальные источники азота и углерода -- бел- ковые гидролизаты (содержат полный набор аминокис- лот), пептиды и пептоны. Универсальные источники витаминов и микроэлементов -- экстракты белков жи- вотного или растительного происхождения и белковые гидролизаты.

рН среды. В некоторых случаях жизнедеятельность бактерий сопровождается сдвигом рН в кислую или щелочную сторону, что требует внесения в среды раз-- личных буферных систем (обычно применяют фосфат-- ный буфер). Сбалансированные среды отличают высо-- кая буферность и стабильный оптимум рН. Важно так- же создание оптимальной концентрации О 2 и СО 2 .

Посев и культивирование

При достаточном содержании патогенных бактерий в образце проводят посев на плотные пита-тельные среды (для получения изолированных колоний). Если в исследуемом материале бактерий мало, то посев проводят на жидкие среды обогащения. На практике выделение относительно неприхотливых бактерий обычно проводят на простых средах (например, на КА, агаре Плоскирева, тиогликолевом бульоне, агаре Сабуро и т.д.). Для выделения прихотливых видов в среды вносят питательные вещества (кровь, сыворотку, дрожжевой экстракт и др.), а такжепогло-тители токсических метаболитов, образующихся при росте бактерий (например, дре-весный уголь). Для посевов применяют микробиологические петли, реже иглы и шпатели.

Получение изолированных колоний

Для получения изолированных колоний на практике наиболее часто используют модифика-цию рассева по Дригальски. Для этого материал наносят на поверхность плотной питательной среды ближе к краю и делают «бляшку». Затем из неё материал распределяют по четырём квадратам, проводя петлёй штрихи, как показано на рис. 1-12, обжигая петлю после засева каждого квадрата. Подобный метод позволяет получить изолированные колонии и изучать их. Исключение составляет техника посева при бактериологическом исследовании мочи (техника штрихового засева показана на рис.1-13). Указанные методы пригодны для посева аэробных и факультативно анаэробных бактерий, а также нестрогих анаэробов.

Температура культивирования

Патогенные бактерии вариабельны в отношении температур, оптимальных для их роста, но большинство из них неплохо развивается при 35-37 °С. Исключение составляют некоторые атипичные микобактерии, возбудитель чумы, листерии и лептоспиры (температурный оптимум 20-30 °С), а также Campylobacter jejuni (температурный оптимум 42 °С).

Бактерии чётко разделяют по отношению к содержанию кислорода в атмосфере культиви-рования.

Аэробы. Посевы аэробных бактерий культивируют в простых термостатах. Некоторые факуль-тативно анаэробные виды также можно культивировать при атмосферном воздухе, но более оптимально помещение посевов в термостаты с дозированной подачей кислорода. На практи-ке их чаще помещают в эксикаторы, куда вносят горящую свечу; после её выгорания в атмо-сфере снижается содержание кислорода и повышается содержание СО 2 .

Анаэробы. Посевы анаэробных бактерий в жидких средах заливают вазелиновым или другим маслом. При использовании плотных сред посевы культивируют в специальных устройствах -- анаэростатах (откуда откачивают воздух) либо заливают посевы тонким слоем агара. Анаэ-робные условия можно создать химическим путём, поместив посевы в эксикаторы, на дно которых заливают щелочной раствор пирогаллола, поглощающего кислород. Также можно использовать методы Фортнера, Цейсслера и Вейнберга.

Метод Фортнера. Посевы проводят на чашку Петри с толстым слоем среды, разделённым пополам узкой канавкой, вырезанной в агаре. На одну половину засевают культуру аэроб-ных бактерий, на другую -- анаэробных. Края чашки заливают парафином и инкубируют в термостате. Первоначально наблюдают рост аэробов, а затем (после поглощения кислоро-да) -- рост анаэробов.

Метод Цейсслера используют для выделения чистых культур спорообразующих анаэробов. Для этого проводят посев на среду Китта-Тароцци, прогревают 15 мин при 80 °С (для унич-тожения вегетативных форм), заливают вазелиновым маслом и инкубируют 24 ч. Затем про-водят посев на сахарно-кровяной агар для получения чистых культур. После 24-часового культивирования подозрительные колонии изучают и отсевают на среду Китта-Тароцци (с последующим контролем чистоты выделенной культуры).

Метод Вейнберга используют для получения чистых культур строгих анаэробов. Культуры, выращенные на среде Китта-Тароцци, вносят в сахарный бульон. Затем пастеровской пи-петкой с запаянным концом материал переносят в узкие пробирки (трубки Виньяля) с сахарным МПА, погружая пастерку до дна пробирки. Засеянные пробирки быстро охлаждают холодной водой, что позволяет зафиксировать отдельные бактериальные клетки в толще затвердевшего агара. Пробирки инкубируют, и изучают выросшие колонии. При обнаружении подозрительной колонии на её месте делают распил, колонию быстро отбирают и засеивают на среду Китта-Тароцци (с последующим контролем чистоты выделенной культуры).

Методы культивирования

При выращивании бактерий применяют стационарный способ, способ глубинного культивирования с аэрацией и метод проточных питательных сред. В соответствии со способами выращивания бактериальные культуры разделяют на периодические (при стационарном и глубинном культивировании) инепрерывные (при проточном культивировании).

Стационарный способ -- наиболее часто используемый на практике. Состав сред остаётся постоянным, с ними не проводят никаких дополнительных манипуляций.

Способ глубинного культивирования применяют при промышленном выращивании бактериальной биомассы, для чего используют специальные котлы-реакторы. Они снабжены систе-мами поддержания температуры, подачи в бульон различных питательных веществ, переме-шивания биомассы и постоянной подачи кислорода. Создание аэробных условий по всей толще среды способствует протеканию энергетических процессов по аэробному пути, что способствует максимальной утилизации энергетического потенциала глюкозы и, следователь-но, максимальному выходу биомассы.

Метод проточных сред (промышленный способ культивирования) позволяет постоянно под-держивать бактериальную культуру в экспоненциальной фазе роста, что достигают постоянным внесением питательных веществ и удалением определённого числа бактериальных клеток. Пре-бывание бактерий в экспоненциальной стадии роста обеспечивает максимальный выход различ-ных БАВ (витамины, антибиотики и др.).

Первичная идентификация бактерий

В большинстве случаев изучение особенностей роста для первичной идентификации возбу-дителей проводят на колониях, выросших в течение 18-24 ч. Характер роста бактерий на раз-личных средах может дать много полезной информации. На практике используют сравнительно небольшой набор критериев. В жидких средах обычно учитывают характер поверхностного (образование плёнки) или придонного роста (вид осадка) и общее помутнение среды. На твёр-дых средах бактерии формируют колонии --изолированные структуры, образующиеся в результате роста и накопления бактерий. Колонии возникают как следствие роста и размноже-ния одной или нескольких клеток. Таким образом,пересев из колонии в дальнейшем даёт возможность оперировать с чистой культурой возбудителя. Рост бактерий на плотных сре-дах имеет больше характерных особенностей.

Размеры и форма колоний

Важные признаки колоний -- их размеры и форма. Колонии могут быть большими или мелкими. Величина колоний -- признак, позволяющий различать различные виды, роды и даже типы бактерий.

В большинстве случаев ко-лонии грамположительных бактерий мель-че колоний грамотрицательных бактерий. Колонии бактерий могут быть плоскими, приподнятыми, выпуклыми, иметь вдавлен-ный или приподнятый центр. Другой важный признак --форма краёв колоний. При изучении фор-мы колоний учитывают характер её поверх-ности: матовый, блестящий, гладкий или ше-роховатый. Края колоний могут быть ров-ными, волнистыми, дольчатыми (глубоко изрезанными), зубчатыми, эрозированными, бахромчатыми и т.д. Размеры и формы ко-лоний часто могут изменяться. Подобные изменения известны какдиссоциации. Наиболее часто обнаруживают S- и R-ducсоциации. S-колонии круглые, гладкие и выпуклые, с ровными краями и блестящей поверхностью. R-колонии -- неправильной формы, шероховатые, с зубчатыми краями.

Цвет колоний

При просмотре посевов также обращают внимание на цвет колоний. Чаще они бесцветные, белые, голубоватые, жёлтые или бежевые; реже -- красные, фиолетовые, зелёные или чёрные. Иногда колонии ирризируют, то есть переливаются всеми цветами радуги [от греч. iris, радуга]. Окрашивание возникает в результате способности бактерий к пигментообразованию. На специ-альных дифференцирующих средах, включающих специальные ингредиенты или красители, ко-лонии могут приобретать разнообразную окраску (чёрную, синюю и др.) за счёт включения красителей либо их восстановления из бесцветной формы. В данном случае их окраска не связана с образованием каких-либо пигментов.

Запах

Запах -- менее важный признак колоний, поскольку вызываемые им ассоциации носят субъективный характер. В частности, культуры синегнойной палочки имеют запах карамели, культуры листерий -- молочной сыворотки, протеев -- гнилостный запах, нокардий -- свежевскопанной земли.

Важным этапом бактериологического исследования ляется посев. В зависимости от цели исследования, харак ра посевного материала и среды используют разные методь посева. Все они включают обязательную цель: оградить пс сев от посторонних микробов. Поэтому работать следует быстро, но без резких движений, усиливающих колебан* воздуха. Во время посевов нельзя разговаривать. ПосевМ лучше делать в боксе (при работе с заразным материалол необходимо выполнять правила личной безопасности).

Этапы выделения чистой культуры:

1-й день - получение изолированных колоний. Кашп исследуемого материала петлей, пипеткой или стеклянной палочкой наносят на поверхность агара в чашке Петри. Шпа-i телем втирают материал в поверхность среды; не прожиг и не перевертывая шпателя, производят посев на 2-й, а тем на 3-й чашке. При таком посеве на 1-ю чашку приходится много материала и соответственно много микробов, на 2-ю меньше и на 3-ю еще меньше.

Можно получить изолированные колонии при посеве петлей. Для этого исследуемый материал эмульгируют в бульоне или изотоническом растворе натрия хлорида.

2-й день - изучают рост микробов на чашках. В 1-й чашке обычно бывает сплошной рост - выделить изолированную колонию не удастся. На поверхности агара во 2-й и 3-й чашке вырастают изолированные колонии. Их изучают невооруженным глазом, с помощью лупы, при малом увеличении микроскопа и иногда в стереоскопическом микроскопе. Нужную колонию отмечают со стороны дна чашки и пересевают на скошенный агар. Посевы ставят в термостат. (Пересевать можно только изолированные колонии.)

3-й день - изучают характер роста на скошенном агаре. Делают мазок, окрашивают его и, убедившись в том, что культура чистая, приступают к ее изучению. На этом выделение чистой культуры заканчивается. Выделенная из определенного источника и изученная культура называется «штаммом».

При выделении чистой культуры из крови (гемокуль-туры) ее предварительно «подращивают» в жидкой среде: 10-15 мл стерильно взятой крови засевают в 100-150 мл жидкой среды. Так поступают потому, что в крови обычно мало микробов. Соотношение засеваемой крови и питательной среды 1: 10 не случайно - так достигается разведение крови (неразведенная кровь губительно действует на микроорганизмы). Колбы с посевом ставят в термостат. Через сутки (иногда через большее время, в зависимости от выделяемой культуры) из содержимого колб делают высевы на чашки для получения изолированных колоний. При необходимости повторяют высевы с интервалом в 2-3 дня.

При выделении чистой культуры из мочи, промывных вод желудка и других жидкостей их предварительно центрифугируют в асептических условиях и засевают осадок. Дальнейшее выделение чистой культуры производят обычным способом.

Для выделения чистой культуры широко применяют элективные среды. В ряде методов для получения чистых культур используют биологические особенности выделяемог микроба. Например, при выделении спорообразующих бак- терий посевы 10 мин прогревают при 80°С, убивая этим ве- гетативные формы. При выделении возбудителя туберкуле-j за, устойчивого к кислотам и щелочам, с помощью этих ве-1 ществ посевной материал освобождают от сопутствующей! флоры. Для выделения пневмококка и палочки чумы иссле-1 дуемый материал вводят белым мышам - в их организме высокочувствительном к данным возбудителям, эти микро-] бы размножаются быстрее других.

В научно-исследовательской работе, особенно при гене-; тических исследованиях, необходимо получать культуры за-1 ведомо из одной клетки. Такая культура называется «клон»] Для ее получения чаще всего пользуются микроманипуля-^ тором - прибором, снабженным инструментами (иглами] пипетками) микроскопических размеров. С помощью дер-j жателя под контролем микроскопа их вводят в препарат «B сячая капля», извлекают нужную клетку (одну) и переносят ее в питательную среду.

Изучение выделенных культур

Изучение морфологии, подвижности, тинкториальныл свойств, характера роста на средах (культуральные свойства);! ферментативной активности и ряда других особенностей вы! деленного микроба позволяет установить его таксономичес| кое положение, т. е. классифицировать микроорганизм: оп| ределить его род, вид, тип, подтип, разновидность. Это на зывается «идентификацией». Идентификация микроорганиз| мов очень важна при диагностике инфекций, установлена источников и путей ее передачи и в ряде других научно-л тических исследований.

Оглавление темы "Посев бактерий. Методы культивирования бактерий. Признаки колоний.":

При достаточном содержании патогенных бактерий в образце проводят посев на плотные питательные среды (для получения изолированных колоний). Если в исследуемом материале бактерий мало, то посев проводят на жидкие среды обогащения. На практике выделение относительно неприхотливых бактерий обычно проводят на простых средах (например, на КА, агаре Плоскирева, тиогликолевом бульоне, агаре Сабуро и т.д.).

Для выделения прихотливых видов бактерий в среды вносят питательные вещества (кровь, сыворотку, дрожжевой экстракт и др.), а также поглотители токсических метаболитов, образующихся при росте бактерий (например, древесный уголь). Для посевов применяют микробиологические петли, реже иглы и шпатели.

Получение изолированных колоний бактерий

Для получения изолированных колоний бактерий на практике наиболее часто используют модификацию рассева по Дригальски. Для этого материал наносят на поверхность плотной питательной среды ближе к краю и делают «бляшку». Затем из неё материал распределяют по четырём квадратам, проводя петлёй штрихи, как показано на рис. 11-12, обжигая петлю после засева каждого квадрата. Подобный метод позволяет получить изолированные колонии и изучать их.

Исключение составляет техника посева при бактериологическом исследовании мочи (техника штрихового засева показана на рис. 11-13). Указанные методы пригодны для посева аэробных и факультативно анаэробных бактерий, а также нестрогих анаэробов.

Температура культивирования бактерий

Патогенные бактерии вариабельны в отношении температур , оптимальных для их роста, но большинство из них неплохо развивается при 35-37 °С. Исключение составляют некоторые атипичные микобактерии, возбудитель чумы, листерии и лептоспиры (температурный оптимум 20-30 °С), а также Campylobacter jejuni (температурный оптимум 42 °С).

78149 0

Культуральные свойства бактерий

К культуральным (или макроморфологическим) свойствам относятся характерные особенности роста микроорганизмов на плотных и жидких питательных средах. На поверхности плотных питательных сред, в зависимости от посева, микроорганизмы могут расти в виде колоний, штриха или сплошного газона.

Колонией называют изолированное скопление клеток одного вида, выросших из одной клетки (клон клеток). В зависимости от того, где растет микроорганизм (на поверхности плотной питательной среды или в толще ее), различают поверхностные, глубинные и донные колонии.

Колонии, выросшие на поверхности среды, отличаются разнообразием: они видоспецифичны и их изучение используется для определения видовой принадлежности исследуемой культуры.

При описании колоний учитывают следующие признаки:
1) форму колонии - округлая, амебовидная, ризоидная, неправильная и т. д.;

2) размер (диаметр) колонии - очень мелкие (точечные) (0,1-0,5 мм), мелкие (0,5-3 мм), средних размеров (3-5 мм) и крупные (более 5 мм в диаметре);

3) поверхность колонии - гладкая, шероховатая, складчатая, морщинистая, с концентрическими кругами или радиально исчерченная;

4) профиль колонии - плоский, выпуклый, конусовидный, кратерообразный и т. д.;

5) прозрачность - тусклая, матовая, блестящая, прозрачная, мучнистая;

6) цвет колонии (пигмент) - бесцветная или пигментированная (белая, желтая, золотистая, красная, черная), особо отмечают выделение пигмента в среду с ее окрашиванием;

7) край колонии - ровный, волнистый, зубчатый, бахромчатый и т. д.;

8) структуру колонии - однородная, мелко- или крупнозернистая, струйчатая; край и структуру колонии определяют с помощью лупы или на малом увеличении микроскопа, поместив чашку Петри с посевом на столик микроскопа крышкой вниз;

9) консистенцию колонии; определяют прикасаясь к поверхности петлей: колония может быть плотной, мягкой, врастающей в агар, слизистой (тянется за петлей), хрупкой (легко ломается при соприкосновении с петлей).

Глубинные колонии чаще всего похожи на более или менее сплющенные чечевички (форма овалов с заостренными концами), иногда комочки ваты с нитевидными выростами в питательную среду. Образование глубинных колоний часто сопровождается разрывом плотной среды, если микроорганизмы выделяют газ.

Донные колонии имеют обычно вид тонких прозрачных пленок, стелющихся по дну.

Особенности колонии могут изменяться с возрастом, они зависят от состава среды и температуры культивирования.

Рост микроорганизмов на жидких питательных средах учитывают, используя четырех-семисуточные культуры, выращенные в стационарных условиях.

В жидких питательных средах при росте микроорганизмов наблюдается помутнение среды, образование пленки или осадка.

При росте на полужидких (0,5-0,7 % агара) питательных средах подвижные микробы вызывают выраженное помутнение, неподвижные формы растут только по ходу посева уколом в среду.

Нередко рост микробов сопровождается появлением запаха, пигментацией среды, выделением газа. Характерный запах культур некоторых видов бактерий связан с образованием различных эфиров (уксусноэтилового, уксусноамилового и др.), индола, меркаптана, сероводорода, скатола, аммиака, масляной кислоты.

Способность образовывать пигменты присуща многим видам микроорганизмов. Химическая природа пигментов разнообразна: каротиноиды, антоцианы, меланины. Если пигмент нерастворим в воде, окрашивается только культуральный налет; если же он растворим, окрашивается и питательная среда. Считается, что пигменты защищают бактерии от губительного действия солнечных лучей, поэтому в воздухе так много пигментированных бактерий, кроме того, пигменты участвуют в обмене веществ этих микроорганизмов.

В природе существуют так называемые фосфоресцирующие бактерии, культуры которых светятся в темноте зеленовато-голубоватым или желтоватым светом. Такие бактерии встречаются главным образом в речной или морской воде. К светящимся бактериям - фотобактериям -относятся аэробные бактерии (вибрионы, кокки, палочки).

Выделение чистых культур микроорганизмов

Чистой культурой называют такую культуру, которая содержит микроорганизмы одного вида. Выделение чистых культур бактерий -обязательный этап бактериологического исследования в лабораторной практике, в изучении микробной загрязненности различных объектов окружающей среды, и в целом при любой работе с микроорганизмами.

Исследуемый материал (вода, почва, воздух, пищевые продукты или другие объекты) обычно содержит ассоциации микробов.

Выделение чистой культуры позволяет изучить морфологические, культуральные, биохимические, антигенные и другие признаки, по совокупности которых определяется видовая и типовая принадлежность возбудителя, т. е. производится его идентификация.

Для выделения чистых культур микроорганизмов используют методы, которые можно разделить на несколько групп:
1. Метод Пастера - последовательное разведение исследуемого материала в жидкой питательной среде до концентрации одной клетки в объеме (имеет историческое значение).

2. Метод Коха («пластинчатые разводки») - последовательное разведение исследуемого материала в расплавленном агаре (температура 48-50 С), с последующим разливом в чашки Петри, где агар застывает. Высевы делают, как правило, из трех-четырех последних разведений, где бактерий становится мало и в дальнейшем при росте на чашках Петри появляются изолированные колонии, образующиеся из одной исходной материнской клетки. Из изолированных колоний в глубине агара получают чистую культуру бактерий пересевом на свежие среды.

3. Метод Шукевича - применяется для получения чистой культуры протея и других микроорганизмов, обладающих «ползущим» ростом. Посев исследуемого материала производят в конденсационную воду у основания скошенного агара. Подвижные микробы (протей) способны подниматься вверх по скошенному агару, неподвижные формы остаются расти внизу, на месте посева. Пересевая верхние края культуры, можно получить чистую культуру.

4. Метод Дригальского - широко применяется в бактериологической практике, при этом исследуемый материал разводят в пробирке стерильным физиологическим раствором или бульоном. Одну каплю материала вносят в первую чашку и стерильным стеклянным шпателем распределяют по поверхности среды. Затем этим же шпателем (не прожигая его в пламени горелки) делают такой же посев во второй и третьей чашках.

С каждым посевом бактерий на шпателе остается все меньше и меньше и, при посеве на третью чашку, бактерии будут распределяться по поверхности питательной среды отдельно друг от друга. Через 1-7 суток выдерживания чашек в термостате (в зависимости от скорости роста микроорганизмов) на третьей чашке каждая бактерия дает клон клеток, образуя изолированную колонию, которую пересевают на скошенный агар с целью накопления чистой культуры.

5. Метод Вейнберга. Особые трудности возникают при выделении чистых культур облигатных анаэробов. Если контакт с молекулярным кислородом не вызывает сразу же гибели клеток, то посев производят по методу Дригальского, но после этого чашки сразу помещают в анаэростат. Однако чаще пользуются методом разведения. Сущность его заключается в том, что разведение исследуемого материала проводят в расплавленной и охлажденной до 45-50 оС агаризированной питательной среде.

Делают 6-10 последовательных разведений, затем среду в пробирках быстро охлаждают и заливают поверхность слоем смеси парафина и вазелинового масла, чтобы помешать проникновению воздуха в толщу питательной среды. Иногда питательную среду после посева и перемешивания переносят в стерильные трубки Бурри или капиллярные пипетки Пастера, концы которых запаивают. При удачном разведении в пробирках, трубках Бурри, пипетках Пастера вырастают изолированные колонии анаэробов. Чтобы изолированные колонии хорошо были видны, используют осветленные питательные среды.

Для извлечения изолированных колоний анаэробов пробирку слегка нагревают, вращая ее над пламенем, при этом агар, прилегающий к стенкам, плавится и содержимое пробирки в виде агарового столбика выскальзывает в стерильную чашку Петри. Столбик агара разрезают стерильным пинцетом и извлекают колонии петлей. Извлеченные колонии помещают в жидкую среду, благоприятную для развития выделяемых микроорганизмов. Агаризированную среду из трубки Бурри выдувают, пропуская газ через ватную пробку.

6. Метод Хангейта. Когда хотят получить изолированные колонии бактерий с особенно высокой чувствительностью к кислороду (строгие аэробы) используют метод вращающихся пробирок Хангейта. Для этого расплавленную агаризированную среду засевают бактериями при постоянном токе через пробирку инертного газа, освобожденного от примеси кислорода. Затем пробирку закрывают резиновой пробкой и помещают горизонтально в зажим, вращающий пробирку; среда при этом равномерно распределяется по стенкам пробирки и застывает тонким слоем. Применение тонкого слоя в пробирке, заполненной газовой смесью, позволяет получить изолированные колонии, хорошо видимые невооруженным глазом.

7. Выделение отдельных клеток с помощью микроманипулятора. Микроманипулятор - прибор, позволяющий с помощью специальной микропипетки или микропетли извлекать одну клетку из суспензии. Эту операцию контролируют под микроскопом. На предметном столике микроскопа устанавливают влажную камеру, в которую помещают препарат «висячая капля». В держателях операционных штативов закрепляют микропипетки (микропетли), перемещение которых в поле зрения микроскопа осуществляется с микронной точностью благодаря системе винтов и рычагов. Исследователь, глядя в микроскоп, извлекает отдельные клетки микропипетками и переносит их в пробирки со стерильной жидкой средой для получения клона клеток.

Л.В. Тимощенко, М.В. Чубик

Цель второго этапа бактериологического метода: получение чистой культуры микроорганизмов и ее накопление. Для этого проводят:

· Макроскопическое изучение колоний в проходящем и отраженном свете (характеристика величины, формы, цвета, прозрачности, консистенции, структуры, контура, поверхности колоний).

· Микроскопическое изучение изолированных колоний, а затем приготовление и просмотр мазков из этих колоний.

· Посев колоний, характерных для определенного вида, на среды накопления чистой культуры или элективные среды и инкубация в оптимальных условиях.

Культуральные признаки микробов определяются харак­тером роста их на питательных средах. Будучи постоянными, для каждого вида микроба, они являются важным диагно­стическим признаком.

Выделяя чистую культуру микроорганизма, следует обращать внима­ние на характер роста микроба, т.е. на культуральные особенности как на один из признаков, позволяющий идентифицировать род, вид микроорга­низма. При культивировании микроба на жидких средах, можно видеть рост бактерий в виде:

а) диффузного помутнения;

б) придонного и пристеночного роста в прозрачной среде;

в) поверхностной пленки;

г) «комочка ваты».

В полужидких средах можно наблюдать:

а) диффузный рост вокруг посева уколом (подвижные бактерии);

б) рост по ходу укола (неподвижные бактерии);

в) разрыв среды или образование пузырьков газа.

На плотных средах наблюдается:

а) рост отдельными колониями;

б) рост сплошным налетом.

Рост микробов на плотной питательной среде. Для изуче­ния свойств колоний микробы культивируют на плотных пи­тательных средах в чашках Петри. При посеве материала стараются получить изолированный рост колоний.

По характеру колоний выделяют следующие типы:

· S-тип (от англ. smooth - гладкий) - колонии характеризуются круглой и выпуклой формой, гладкой поверхностью, влажной консистенцией;

· R –тип (от англ. rough – шероховатый) колонии характеризуются шероховатой поверхностью, неправильными краями, сухой консистенцией. Образуются из гладких S -форм в результате мутаций. Переход S-форм в R-формы наблюдается при диссо­циации. Явление диссоциации у патогенных микробов на­блюдается под действием антибиотико - и химиотерапии, фак­торов специфического иммунитета, формирующихся в течение инфекционного процесса, а также факторов внешней среды.

· Помимо этих двух основных типов колоний существует слизистый М-тип (от лат. mucus - слизистый), характеризующийся тягучей слизистой консистенцией. Образуется в процессе диссоциаций бактериальных культур.

Бактерии каждого вида формируют колонии с различными признаками. Их характер изучают невооруженным глазом в проходящем и отраженном свете, а также с помощью лупы или микроскопа с малым увеличением. В начале исследования чашку поворачивают дном к себе и рассматривают чашки в проходящем свете. При наличии разных колоний каждую из них нумеруют и описывают в отдельности. В протоколе отмечают следующие характеристики.

1. Величина колоний определяется ее диаметром (крупные – диаметром 4-6 мм и более, средние – 2-4мм, мелкие – 1-2мм и точечные – менее 1мм).

2. Форма колоний (правильная круглая, неправильная амебовидная, розеткообразная, ризоидная - корневидная, напоминающая переплетающиеся корни деревьев и т.п.).

3. Степень прозрачности (непрозрачная, полупрозрачная, прозрачная).

4. Структуру колоний. По характеру структуры различают следующие виды ко­лоний:

· гиалиновые - бесцветные, прозрачные, без видимой определенной структуры;

· зернистые, которые в зависимости от величины зерен разделяются на мелко - и грубозернистые;

· нитевидные или волокнистые, характеризующиеся на­личием длинных, густо переплетающихся нитей в толще ко­лонии. Колонии бывают однородные и неоднородные. Строение первых одинаково во всех частях, у вторых центральная часть отличается от периферической или отдельные сектора имеют строение, неодинаковое с остальной массой.

5. Цвет колонии определяется пигментом, который проду­цирует культура микробов. Преобладающее большинство патогенных бактерий пигмента не образует, вследствие чего колонии их бесцветны или молочно-мутного цвета, похожи на опал. В проходящем свете такие колонии в большей или меньшей степени прозрачны. Пигментообразующие виды мик­робов дают колонии различных цветов: кремовые, желтые, золотисто-оранжевые, синие, красные, сиреневые, черные и др.

6. Характер поверхности (шероховатая, блестящая, матовая, сухая, влажная, гладкая, радиально или концентрически исчерченная).

7. Характер контура края. Различают ровные края в виде четко выраженной ли­нии и неровные. Последние делят на:

· фестончатый край, состоящий из крупных, слегка округ­лых или уплощенных зубцов правильной формы;

· волнистый край, который несколько отличается от фе­стончатого тем, что крупные зубцы его выражены нечетко;

· эрозированный, или зазубренный, край, состоящий из острых зубцов различной величины и формы;

· бахромчатый край, имеющий нежные ворсинки. В некоторых случаях четко выраженная линия, отграни­чивающая колонию от поверхности среды, отсутствует. Такой край колонии называется расплывчатым.

8. Рельеф характеризуется приподнятостью ее над поверхностью питательной среды и контуром формы в вертикальном разрезе. Различают рельеф выпуклый, вдавленный, плоский, конусообразный, куполообразный, плоский с конусовидным центром, с утолщенными валикообразными краями и т. п.

9. Консистенцию колонии , определяющую ее физиче­ское состояние, исследуют посредством прикосновения или взятия из нее части материала бактериологической петлей бактериальной петлей. По характеру консистенции колонии бывают:

· пастообразные, легко снимающиеся и размывающиеся по поверхности питательной среды наподобие сливочного масла;

· вязкие или слизистые, прилипающие и тянущиеся за петлей

· волокнистые или кожистые, плотные, снимающиеся с поверхности питательной среды в виде упругой пленки, соот­ветствующей величине и форме колонии;

· хрупкие, сухие, рассыпающиеся при прикосновении петли.

Колонии некоторых видов бактерий врастают в толщу питательной среды, что также определяют бактериологической петлей.

10. Запах - менее важный признак колоний, поскольку вызываемые им ассоциации носят субъективный характер. Многие виды бактерий в процессе роста на питательных средах выделяют специфические ароматические вещества. В частности, культуры синегнойной палочки имеют запах карамели, культуры листерий – молочной сыворотки, нокардий – свежевскопанной земли, протеев – гнилостный запах.

III. План практической работы

1. Изучить культуральные свойства колоний, выросших на МПА (просмотр посевов сделанных на предыдущем занятии)

2. Изолированную колонию (чистую культуру) отсеять (штрихами) на среду накопления (скошенный МПА)

3. Изучить и зарисовать характер роста различных бактерий на простых и сложных питательных средах

4. Заполнить таблицу « Классификация микроорганизмов по типам дыхания»

5. Решить ситуационные задачи