Механизмы сохранения нуклеогидной последовательности ДНК. Химическая стабильность

Оглавление темы "Генетические элементы бактерий. Мутации у бактерий. Трансдукция.":
1. Мигрирующие генетические элементы бактерий. Транспозоны. Бактериофаги, как мигрирующие генетические элементы.
2. Мутация. Мутации у бактерий. Мутагены. Спонтанные мутации. Обратные мутации (реверсии).
3. Индуцированные мутации бактерий. Химический мутагенез. Радиационный мутагенез. Типы мутаций.
4. Репарация ДНК бактерий. Системы репарации днк. Компенсация функций нарушенных в результате мутаций. Интрагенная супрессия. Экстрагенная супрессия.
5. Перенос бактериальной ДНК. Конъюгация бактерий. F-фактор бактерии.
6. Трансформация бактерий. Стадии трансформации бактерии. Картирование хромосом бакетерий.
7. Трансдукция. Неспецифическая трансдукция. Специфическая трансдукция. Абортивная трансдукция. Феномен лизогении.
8. Свойства бактерий. Ненаследуемые изменения свойств бактерий. S - колонии. R - колонии. M - колонии. D - колонии бактерий. Репарация ДНК бактерий. Системы репарации днк. Компенсация функций нарушенных в результате мутаций. Интрагенная супрессия. Экстрагенная супрессия.

В клетке существуют механизмы, способные полностью или частично восстанавливать исходную структуру изменённой ДНК. Мутации, вызванные радиацией, химическими веществами и другими факторами, теоретически могли бы привести к вымиранию бактериальной популяции, если бы последняя была лишена способности к репарации ДНК . Совокупность ферментов, катализирующих коррекцию повреждений ДНК, объединяют в так называемые системы репарации, принципиально различающиеся по биохимическим механизмам «залечивания» повреждений. Известно три основных направления коррекции дефектов ДНК.

1. Непосредственная реверсия от повреждённой ДНК к исходной структуре, когда изменения в ДНК исправляются с помощью единственной ферментативной реакции. Например, удаление неправильно присоединённой метильной группы при шестом атоме кислорода гуанина с помощью метилтрансферазы; или расщепление возникшего в результате облучения тиминового димера с помощью фотолиазы (рекомбинационная репарация ).

2. «Вырезание» повреждений с последующим восстановлением исходной структуры (эксцизионная репарация).

3. Активация особых механизмов , обеспечивающих выживание при повреждениях ДНК (восстановление исходной структуры ДНК в результате рекомбинации; коррекция ошибочного спаривания оснований; трансляционный синтез на повреждённой матрице ДНК ). Эти механизмы не всегда приводят к полному восстановлению исходной структуры ДНК.

Компенсация функций, нарушенных в результате мутаций

Первичная мутация может быть компенсирована вторичной мутацией, которая произошла внутри мутировавшего гена (интрагенно) или в другом гене (экстрагенно). Изменения, которые устраняют проявления мутации, не исправляя при этом первоначального нарушения в ДНК , называют супрессией .

Интрагенная супрессия вызвана вторичной мутацией, корригирующей эффекты первичной мутации. Например, точечная мутация, приводящая к синтезу дефектного белка с утраченной биологической активностью, может быть исправлена, если вторичная точечная мутация приведёт к кодированию аминокислоты, сохраняющей конфигурацию и активность белка. Точное восстановление исходной структуры гена называют истинной обратной мутацией (истинной реверсией ). Если эффект первой мутации компенсирован мутацией в другой части гена, такие мутации называют вторичными реверсиями.

Экстрагенная супрессия - подавление проявления мутации, произошедшей в одном гене, вследствие мутации во втором гене.

Для поддержания главных характеристик клетки или организма на протяжении их жизни, а также в ряду поколений наследственный материал должен отличаться устойчивостью к внешним воздействиям или должны существовать механизмы коррекции возникающих в нем изменений. В живой природе используются оба фактора. Третьим фактором является точность копирования нуклеотидных последовательностей материнской ДНК в процессе ее репликации.

Рис. 3. 13. Белки, участвующие в процессе репликации ДНК

ДНК-геликаза расплетает двойную спираль ДНК, разделяя ее полинуклеотидные цепи; дестабилизирующие белки выпрямляют участок цепи ДНК; ДНК-топоизомераза разрывает фосфодиэфирную связь в одной из полинуглеотидных цепей ДНК, снимая напряжение, вызываемое расплетенисм спирали и расхождением цепей в репликационной вилке; РНК-праймаза синтезирует РНК-затравки для дочерней цепи и для каждого фрагмента Оказаки; ДНК-полимераза осуществляет непрерывный синтез лидирующей цепи и синтез фрагментов Оказаки отстающей цепи; ДНК-лигаза сшивает фрагменты Оказаки после удаления РНК-затравки

По реакционной способности молекулы ДНК относятся к категории химически инертных веществ. Известно, что роль вещества наследственности может выполнять не только ДНК, но и РНК (некоторые вирусы). Считают, что выбор в пользу ДНК обусловлен ее более низкой по сравнению с РНК реакционной способностью.

Рассмотренный выше механизм репликации отличается чрезвычайно высокой точностью воспроизведения структуры ДНК. При удвоении ДНК ошибки возникают в среднем с частотой 1·10 -6 комплементарных пар оснований.

В поддержании высокой точности репликации важная роль принадлежит прежде всего ферменту ДНК-полимеразе. Этот фермент осуществляет отбор необходимых нуклеотидов из числа имеющихся в ядерном соке нуклеозидтрифосфатов (АТФ, ТТФ, ГТФ, ЦТФ), точное присоединение их к матричной цепи ДНК и включение в растущую дочернюю цепь (см. рис. 3.10). Частота включения неправильных нуклеотидов на этой стадии составляет 1·10 -5 пар оснований.

Такие ошибки в работе ДНК-полимеразы связаны с возникновением измененных форм азотистых оснований, которые образуют «незаконные» пары с основаниями материнской цепи. Например, измененная форма цитозина вместо гуанина связывается водородными связями с аденином. В результате в растущую цепь ДНК включается ошибочный нуклеотид. Быстрый переход измененной формы такого основания в обычную нарушает его связывание с матрицей, появляется неспаренный 3"-ОН-конец растущей цепи ДНК. В этой ситуации включается механизм самокоррекции , осуществляемый ДНК-полимеразой (или тесно связанным с ней ферментом - редактирующей эндонуклеазой). Самокоррекция заключается в отщеплении ошибочно включенного в цепь ДНК нуклеотида, не спаренного с матрицей (рис. 3.14). Следствием самокоррекции является снижение частоты ошибок в 10 раз (с 10 -5 до 10 -6).

Несмотря на эффективность самокоррекции, в ходе репликации после удвоения ДНК в ней обнаруживаются ошибки. Особенно часто это наблюдается при нарушении концентрации четырех нуклеозидтрифосфатов в окружающем субстрате. Значительная часть изменений возникает также в молекулах ДНК в результате спонтанно происходящих процессов, связанных с потерей пуриновых оснований - аденина и гуанина (апуринизацией) - или дезаминированием цитозина, который превращается в урацил. Частота последних изменений достигает 100 на 1 геном/сут.

Содержащиеся в ДНК основания могут изменяться под влиянием реакционноспособных соединений, нарушающих их нормальное спаривание, а также под действием ультрафиолетового излучения, которое может вызвать образование ковалентной связи между двумя соседними остатками тимина в ДНК (димеры тимина). Названные изменения в очередном цикле репликации должны привести либо к выпадению пар оснований в дочерней ДНК, либо к замене одних пар другими. Указанные изменения действительно сопровождают каждый цикл репликации ДНК, однако их частота значительно меньше, чем должна была бы быть. Это объясняется тем, что большинство изменений такого рода устраняется благодаря действию механизма репарации (молекулярного восстановления) исходной нуклеотидной последовательности ДНК.

Механизм репарации основан на наличии в молекуле ДНК двух комплементарных цепей. Искажение последовательности нуклеотидов в одной из них обнаруживается специфическими ферментами. Затем соответствующий участок удаляется и замещается новым, синтезированным на второй комплементарной цепи ДНК. Такую репарацию называют эксцизионной, т.е. с «вырезанием» (рис. 3.15). Она осуществляется до очередного цикла репликации, поэтому ее называют также дорепликативной .

Рис. 3.14. Схема процесса коррекции при синтезе ДНК:

I -включение в цепь ДНК нуклеотида с измененной (таутомерной) формой цитоэина, который «незаконно» спаривается с аденином; II - быстрый переход цитозина в обычную форму нарушает его спаривание с аденином; неспаренный 3"-ОН-конец синтезируемой цепи препятствует дальнейшему ее удлинению под действием ДНК-полимеразы; III - ДНК-полимераза удаляет незаконный нуклеотид, в результате чего вновь появляется спаренный с матрицей 3 "- ОН-конец; IV - ДНК-полимераза продолжает наращивание цепи на 3"-ОН-конце

Восстановление структуры ДНК при утрате пуриновых оснований одной из ее цепей предполагает обнаружение дефекта с помощью фермента эндонуклеазы, которая разрывает фосфоэфирную связь в месте повреждения цепи. Затем измененный участок с несколькими примыкающими к нему нуклеотидами удаляется ферментом экзонуклеазой, а на его месте в соответствии с порядком оснований комплементарной цепи образуется правильная нуклеотидная последовательность (рис. 3.15).

Рис. 3.15. Схема эксцизионной, дорепликативной репарации ДНК

При изменении одного из оснований в цепи ДНК в восстановлении исходной структуры принимают участие ферменты ДНК-гликозилазы числом около 20. Они специфически узнают повреждения, обусловленные дезаминированием, алкилированием и другими структурными преобразованиями оснований. Такие модифицированные основания удаляются. Возникают участки, лишенные оснований, которые репарируются, как при утрате пуринов. Если восстановление нормальной структуры не осуществляется, например в случае дезаминирования азотистых оснований, происходит замена одних пар комплементарных оснований другими -пара Ц-Г может заменяться парой Т-А и т.п. (см. разд. 3.4.2.3).

Образование в полинуклеотидных цепях под действием УФ-лучей тиминовых димеров (Т-Т) требует участия ферментов, узнающих не отдельные измененные основания, а более протяженные повреждения структуры ДНК. Репаративный процесс в этом случае также связан с удалением участка, несущего димер, и восстановлением нормальной последовательности нуклеотидов путем синтеза на комплементарной цепи ДНК.

В том случае, когда система эксцизионной репарации не исправляет изменения, возникшего в одной цепи ДНК, в ходе репликации происходит фиксация этого изменения и оно становится достоянием обеих цепей ДНК. Это приводит к замене одной пары комплементарных нуклеотидов на другую либо к появлению разрывов (брешей) во вновь синтезированной цепи против измененных участков. Восстановление нормальной структуры ДНК при этом может произойти и после репликации.

Пострепликативная репарация осуществляется путем рекомбинации (обмена фрагментами) между двумя вновь образованными двойными спиралями ДНК. Примером такой пострепликативной репарации может служить восстановление нормальной структуры ДНК при возникновении тиминовых димеров (Т-Т), когда они не устраняются самопроизвольно под действием видимого света (световая репарация ) или в ходе дорепликативной эксцизионной репарации.

Ковалентные связи, возникающие между рядом стоящими остатками тимина, делают их не способными к связыванию с комплементарными нуклеотидами. В результате во вновь синтезируемой цепи ДНК появляются разрывы (бреши), узнаваемые ферментами репарации. Восстановление целостности новой полинуклеотидной цепи одной из дочерних ДНК осуществляется благодаря рекомбинации с соответствующей ей нормальной материнской цепью другой дочерней ДНК. Образовавшийся в материнской цепи пробел заполняется затем путем синтеза на комплементарной ей полинуклеотидной цепи (рис. 3.16). Проявлением такой пострепликативной репарации, осуществляемой путем рекомбинации между цепями двух дочерних молекул ДНК, можно считать нередко наблюдаемый обмен материалом между сестринскими хроматидами (рис. 3.17).

Рис. 3.16. Схема пострепликативной репарации ДНК:

I - возникновение тиминового димера в одной из цепей ДНК;

II - образование «бреши» во вновь синтезируемой цепи против измененного участка материнской молекулы после репликации (стрелкой показано последующее заполнение «бреши» участком из соответствующей цепи второй дочерней молекулы ДНК);

III - восстановление целостности дочерней цепи верхней молекулы за счет рекомбинации и в нижней молекуле за счет синтеза на комплементарной цепи

Рис. 3.17. Межхроматидные обмены (указаны стрелками)

В ходе дорепликативной и пострепликативной репарации восстанавливается большая часть повреждений структуры ДНК. Однако, если в наследственном материале клетки возникает слишком много повреждений и часть из них не ликвидируется, включается система индуцируемых (побуждаемых) ферментов репарации (SOS-система). Эти ферменты заполняют бреши, восстанавливая целостность синтезируемых полинуклеотидных цепей без точного соблюдения принципа комплементарности. Вот почему иногда сами процессы репарации могут служить источником стойких изменений в структуре ДНК (мутаций). Названная реакция также относится к SOS-системе.

Если в клетке, несмотря на осуществляемую репарацию, количество повреждений структуры ДНК остается высоким, в ней блокируются процессы репликации ДНК. Такая клетка не делится, а значит, не передает возникших изменений потомству.

Вызываемая повреждениями ДНК остановка клеточного цикла в сочетании с невозможностью молекулярной репарации измененного наследственного материала может с участием белка, синтез которого контролируется геном р53, приводить к активации процесса самоликвидации (апотпоз) дефектной клетки с целью устранения ее из организма.

Таким образом, обширный набор различных ферментов репарации осуществляет непрерывный «осмотр» ДНК, удаляя из нее поврежденные участки и способствуя поддержанию стабильности наследственного материала. Совместное действие ферментов репликации (ДНК-полимераза и редактирующая эндонуклеаза) и ферментов репарации обеспечивает достаточно низкую частоту ошибок в молекулах ДНК, которая поддерживается на уровне 1 · 10 -9 пар измененных нуклеотидов на геном. При размере генома человека 3 · 10 9 нуклеотидных пар это означает появление около 3 ошибок на реплицирующийся геном. Вместе с тем даже этот уровень достаточен для образования за время существования жизни на Земле значительного генетического разнообразия в виде генных мутаций.

ДНК - это линейный полимер, содержащий от 70-80 до 10 9 мононуклеотидов, которые соединяются ковалентными фосфодиэфирными связями, возникающими между гидроксильной группой пентозы одного нуклеотида и фосфатной группой следующего нуклеотида.

Данные рентгеноструктурного анализа показали, что молекула ДНК большинства живых организмов, за исключением некоторых фагов, состоят из двух полинуклеотидных цепей, антипараллельно направленных и ориентированных таким образом, что их сахарофосфатные остовы оказываются снаружи, а азотистые основания - внутри. Основания располагаются парами друг против друга и соединяются водородными связями. Спаривание происходит только между комплементарными (подходящими друг другу) основаниями: одним пуриновым и одним перимединовым. Пара А-Т соединяется двумя, а Г-Ц тремя водородными связями. Молекула ДНК имеет форму двойной спирали, в котором полинуклеотидные цепи закручены вокруг воображаемой центральной оси.

Спираль ДНК характеризуется рядом параметров:

ширина спирали около 2 нм;

шаг или полный оборот спирали составляет 3,4 нм и содержит 10 пар комплементарных нуклеотидов.

ДНК обладает уникальными свойствами: способностью к самоудвоению (репликации) и способностью к самовосстановлении (репарации).

20 белков: узнающих измененные участки ДНК и удаляющие их из цепи, восстанавливающих правильную последовательность нуклеотидов и сшивающих восстановленный фрагмент с остальной молекулой ДНК.5% всей клеточной РНК.

Репликация осуществляется под контролем ряда ферментов и протекает в несколько этапов. Она начинается в определенных точках молекулы ДНК. Специальные ферменты разрывают водородные связи между комплементарными азотистыми, и спираль раскручивается. Поинуклеотидные цепи материнской молекулы удерживаются в раскрученном состоянии и служат матрицей для синтеза новых цепей.

С помощью фермента ДНК-полимеразы из имеющихся в среде трифосфатов дезоксирибонуклеотидов (дАТФ, дГТФ, дЦТФ, дТТФ) комплементарно материнским цепям собираются дочерние цепи. Репликация осуществляется одновременно на обеих материнских цепях, но с разной скоростью и снекоторыми отличиями. На одном из цепей (лидирующей) сборка дочерней цепи идет непрерывно, на другой (отставщей) - фрагментароно. В последующем синтезированные фрагменты смешиваются с помощью фермента ДНК лигазы. В результате из одной молекулы ДНК образуется две, каждая и которых имеет материнскую и дочернюю цепи. Синтезированные молекулы являются точными копиями друг друга и исходной молекулы ДНК. Такой способ репликации ДНК называется полуконсервативным и обеспечивает точное воспроизведение в дочерних молекулах той информации, которая была записана в материнской молекуле.

Репарацией называется способность молекулы ДНК "исправлять" возникающие в ее цепях изменения. В восстановлении исходной молекулы ДНК участвует не менее

Перечисленные особенности химической структуры и свойств ДНК обусловливают выполняемые ею функции. ДНК записывает, хранит, воспроизводит генетическую информацию, участвует в процессах ее реализации между новыми поколениями клеток и организмов.

Рибосомная РНК (рРНК) синтезируется в основном в ядрышке, в области генов рРНК и представлена разнообразными по молекулярной массе молекулами, входящими в состав большой или малой субчастиц рибосом. На долю рРНК приходиться 85% всей РНК клетки.

Транспортная РНК (тРНК) составляет около 10% клеточной РНК. Существует более 40 видов тРНК. При реализации генетической информации каждая тРНК присоединяет определенную аминокислоту и транспортирует ее к месту сборки полипептида. У эукариот тРНК состоят из 70-90 нуклеотидов и имеют структуру в виде "клеверного листа".

Рибонуклеиновые кислоты - РНК - представлены разнообразными по размерам, структуре и выполняемым функциям молекулами. Все молекулы РНК являются копиями определенных участков молекулы ДНК и, помимо уже указанных отличий, оказывается короче ее и состоит из одной цепи. Между отдельными комплементарными друг другу участками одной цепи РНК возможно спаривание оснований (А-У, Г-Ц) и образование спиральных участков. В результате молекулы приобретают специфическую конформацию.

Матричная, или информационная, РНК (мРНК, иРНК) синтезируется в ядре под контролем фермента РНК-полимеразы комплементарно информативным последовательностям ДНК, переносит эту информацию на рибосомы, где становится матрицей для синтеза белковой молекулы. В зависимости от объема копируемой информации молекула иРНК может иметь различную длину и составляет около 5% всей клеточной РНК.

Механизм репарации основан на наличии в молекуле ДНК двух комплементарных цепей. Искажение последовательности нуклеотидов в одной из них обнаруживается специфическими ферментами. Затем соответствующий участок удаляется и замещается новым, синтезированным на второй комплементарной цепи ДНК. Такую репарацию называют эксцизионной, т.е. с "вырезанием" (рис.15). Она осуществляется до очередного цикла репликации, поэтому ее называют также дорепликативной.

Рис.14. Схема процесса коррекции при синтезе ДНК:

I-включение в цепь ДНК нуклеотида с измененной (таутомерной) формой цитоэина, который "незаконно" спаривается с аденином; II - быстрый переход цитозина в обычную форму нарушает его спаривание с аденином; неспаренный 3"-ОН-конец синтезируемой цепи препятствует дальнейшему ее удлинению под действием ДНК-полимеразы; III - ДНК-полимераза удаляет незаконный нуклеотид, в результате чего вновь появляется спаренный с матрицей 3 "-ОН-конец; IV - ДНК-полимераза продолжает наращивание цепи на 3"-ОН-конце.

Восстановление исходной структуры ДНК требует участия ряда ферментов. Важным моментом в запуске механизма репарации является обнаружение ошибки в структуре ДНК. Нередко такие ошибки возникают во вновь синтезированной цепи в процессе репликации. Ферменты репарации должны обнаружить именно эту цепь. У многих видов живых организмов вновь синтезированная цепь ДНК отличается от материнской степенью метилирования ее азотистых оснований, которое отстает от синтеза. Репарации при этом подвергается неметилированная цепь. Объектом узнавания ферментами репарации могут также служить разрывы в цепи ДНК. У высших организмов, где синтез ДНК происходит не непрерывно, а отдельными репликонами, вновь синтезируемая цепь ДНК имеет разрывы, что делает возможным ее узнавание. Восстановление структуры ДНК при утрате пуриновых оснований одной из ее цепей предполагает обнаружение дефекта с помощью фермента эндонуклеазы, которая разрывает фосфоэфирную связь в месте повреждения цепи. Затем измененный участок с несколькими примыкающими к нему нуклеотидами удаляется ферментом экзонуклеазой, а на его месте в соответствии с порядком оснований комплементарной цепи образуется правильная нуклеотидная последовательность (рис.15).

Рис.15. Схема эксцизионной, дорепликативной репарации ДНК.

При изменении одного из оснований в цепи ДНК в восстановлении исходной структуры принимают участие ферменты ДНК-гликозилазы числом около 20. Они специфически узнают повреждения, обусловленные дезаминированием, алкилированием и другими структурными преобразованиями оснований. Такие модифицированные основания удаляются. Возникают участки, лишенные оснований, которые репарируются, как при утрате пуринов. Если восстановление нормальной структуры не осуществляется, например в случае дезаминирования азотистых оснований, происходит замена одних пар комплементарных оснований другими - пара Ц-Г может заменяться парой Т-А и т.п. .

Повреждение и починка ДНК,
или
“На всякую прореху найдется заплата”

Н.П.Шарова, Е.Б.Абрамова

Наталья Петровна Шарова, доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник Института биологии развития им.Н.К.Кольцова РАН.
Елена Борисовна Абрамова, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник того же института.

Записанная в ДНК генетическая программа любого живого существа - от простейшего одноклеточного до высокоорганизованного многоклеточного - сохраняется в череде потомков благодаря точному воспроизведению нуклеотидной последовательности в каждом поколении. Но если в главной наследственной молекуле возникают повреждения, а это случается даже спонтанно, изменения в ее структуре могут привести не только к разным патологиям тканей или органов, но и к передаче мутации потомству. И, как это ни удивительно, ДНК - единственная клеточная макромолекула, способная исправлять повреждения в собственной структуре. В ней даже закодирована информация о механизмах тех процессов, которые занимаются таким ремонтом (в строго научной среде их называют репарационными). Именно “починка” ДНК обеспечивает запас прочности организма.

Восстановление структуры ДНК особенно важно при формировании репродуктивных (половых) клеток и в эмбриональном развитии: во время активного синтеза новых цепей риск появления и повторения ошибок многократно увеличивается. Наследственная молекула должна залечиваться очень быстро, и делящиеся эмбриональные клетки “знают”, как это осуществить. Устраняются разные повреждения ДНК и в течение всей жизни организма. Начнем рассказ с известных к настоящему времени типов повреждений, чтобы затем рассмотреть механизмы починки, потому что от характера неисправности зависит, каким способом она будет ликвидирована.

Что может испортиться в ДНК

Поломки возможны в любом из образующих ДНК компонентов - и в азотистых основаниях, и в сахарофосфатном остове, причем как при копировании (репликации), так и при считывании (транскрипции) информации для последующего синтеза клеточных белков.

Часто случаются апуринизация того или иного нуклеотида и дезаминирование оснований. В первом случае рвутся гликозидные связи между пурином (аденином или гуанином) и дезоксирибозой, в результате чего эти основания выщепляются из цепи ДНК (место, в котором произошло такое событие, называют АП-сайтом). Второй случай - дезаминирование - приводит к образованию несвойственных для структуры ДНК соединений: вместо цитозина, аденина или гуанина появляются урацил, гипоксантин или ксантин, соответственно. Оба процесса спонтанные. За сутки в клетке человека апуринизация повторяется 5-10 тыс. раз, а частота дезаминирования составляет примерно 100 событий на полный геном.

Действие ультрафиолетового облучения приводит к насыщению двойных связей пиримидиновых оснований и образованию димеров из двух соседних пиримидинов в одной цепи ДНК. Ионизирующая радиация может вызвать несколько повреждений: разрыв пуринового кольца, фрагментацию основания, окисление апуринового сайта, а также одно- и двухцепочечные разрывы (это фактически разлом хромосом - главная причина летального действия ионизирующей радиации). Некоторые химические агенты способны сшивать цепи ДНК. Активные формы кислорода (ОН·, О 2 ·– , Н 2 О 2 , перекиси липидов и др.), постоянно генерируемые в процессах метаболизма, повреждают и основания, и дезоксирибозу, что способствует образованию новых ковалентных связей. Особенно подвержены окислительному действию соседствующие гуанины (GG). Это буквально “горячие точки” такого процесса, а его конечный результат - модифицированное производное гуанозина. Сахарофосфатные связи разрушаются в тех случаях, когда обе нити ДНК лишились пуринов в противолежащих друг другу местах или вблизи произошла фрагментация дезоксирибозы. Тогда рвутся сразу обе цепи ДНК. Источником структурных дефектов может быть и естественный процесс - репликация, если в комплементарных цепях появляются неспаренные нуклеотиды.

Слева - Нормальная молекула ДНК (фрагмент) и схемы образования наиболее частых повреждений - дезаминирования, апуринизации и циклобутановых димеров. При дезаминировании цитозин превращается в урацил, а аденин - в гипоксантин. Если разрывается связь между остатком дезоксирибозы и пуриновым основанием (здесь аденин и гуанин), в этом месте остается только сахарофосфатный остов, т.е. возникает апуриновый сайт. Под действием ультрафиолета в ДНК может образоваться циклобутановый димер из двух соседних пиримидинов (тиминов), находящихся в одной цепи (вверху ).

Внизу - Повреждения, которые могут возникать в ДНК спонтанно или под действием разных агентов.

Клетка способна устранить перечисленные повреждения, несмотря на их различия, и восстановить структуру ДНК. Вполне понятно, что для этого требуются специальные механизмы. И хотя в частностях они отличаются один от другого и бывают весьма сложными, все же подчиняются общим принципам. Сначала опознается вид возникшей неисправности. Этим занимаются один белок или несколько (тогда они объединяются в месте изъяна в комплекс). Затем поврежденный участок вырезается в ходе ферментативных реакций, после чего ДНК-полимераза синтезирует правильный кусок ДНК. Завершается репарация сшиванием отдельных фрагментов цепи ДНК-лигазой. Такова общая схема, но каждый тип ремонта осуществляют собственные белки и ферменты, определяющие его индивидуальность. Не правда ли, эта схема напоминает обычное латание дыр на одежде?

Молекулярные ножницы и заплатки

Большая часть структурных нарушений в ДНК устраняется вырезанием (этот тип репарации специалисты называют эксцизионной; по-англ. excision repair ), которое осуществляют ферменты нуклеазы. Бракованное основание удаляется в одиночку или вместе с окружением - участками цепи в 2-10 нуклеотидов. Так вырезаются модифицированные и поврежденные основания, апуриновые сайты и места с одноцепочечными разрывами. (Данная разновидность названа эксцизионной репарацией основания; base excision repair, BER.) В случае более крупных неисправностей - возникновения пиримидиновых димеров или других объемных образований в ДНК, нарушающих структуру спирали, - клеточные ножницы отстригают испорченную часть в составе куска длиной в 30 нуклеотидов. (Это уже эксцизионная репарация нуклеотида, nucleotide excision repair, NER.)

Каков будет размер вырезаемого куска, а значит, и заплаты, зависит от самого повреждения и соотношения имеющихся в клетке ДНК-полимераз. Эти ферменты застраивают бреши, образовавшиеся после вырезания аномального участка, используя в качестве матрицы фрагмент противоположной цепи ДНК. ДНК-полимеразы (у эукариот их известно более 15) различаются по ряду признаков, в том числе по количеству нуклеотидов, которые они успевают встроить в растущую цепь за один акт связывания с дуплексом ДНК. Полимеразы b и l присоединяют всего один нуклеотид, т.е. накладывают маленькую заплатку (short patch путь BER, как говорят специалисты). Две другие ДНК-полимеразы - d и e - способны создать большую вставку, но для этого им нужен специальный помощник - белок PCNA (proliferating cell nuclear antigen ). Особенно зависим от него первый фермент - без помощника он “отваливается” от ДНК, встроив лишь один нуклеотид, а если PCNA удерживает на ней полимеразу d , то синтез идет до тех пор, пока фрагмент не достигнет нужной длины. Если в клетке не хватает той или иной ДНК-полимеразы, репарация может переключиться с одного пути на другой, т.е. с малой заплаты на большую (long patch путь BER). Клеточные линии фибробластов мышиных эмбрионов восстанавливают нормальную структуру на месте апуринизации преимущественно посредством малой заплатки (в 80% событий), а если в клетках поврежден ген ДНК-полимеразы b , починка проходит исключительно наложением большой заплаты. Кстати, способ латания дыр клеткой зависит и от того, сколько в ней содержится белка PCNA.

Мелкие неполадки. Если в ДНК изменено одно основание, его распознают, а потом вырезают N-гликозилазы, и в результате в цепи остается дезоксирибозофосфат (как при апуринизации). Далее сахарофосфатный остов надрезается АП-эндонуклеазой (класса II) с 5ў -стороны от этого промежуточного продукта, похожего на АП-сайт. Совсем удалить его клетка может двумя способами (short patch или long patch BER): вырезав только сам остаток дезоксирибозофосфата или вместе с окружающими двумя-десятью нуклеотидами. По размеру образовавшейся дырки синтезируется и заплата. Брешь в один нуклеотид застраивается ДНК-полимеразой b . Иное дело, если появившийся в ДНК АП-сайт еще и подвергся окислению или восстановлению. Такую структурную аномалию вместе с окружающими нуклеотидами вырезает другой фермент - нуклеаза FEN1, - а образовавшуюся брешь застраивают ДНК-полимеразы d или e , которые работают только с помощником - белком PCNA. Иногда короткие пробелы (длиной до 5-6 нуклеотидов) заполняют ДНК-полимеразы b или l . Помощник им не нужен, так как они сами могут временно “заякориться” на свободном 5ў -конце цепи, прилежащем к бреши, и задержаться на какое-то время на ДНК, чтобы осуществить ресинтез вырезанного участка.

Мы несколько лет занимаемся исследованием репарации у костистых рыб в период их эмбрионального развития. В этот период онтогенеза активно синтезируются новые цепи ДНК, и потому риск появления и повторения ошибок многократно увеличивается. Чтобы не произошло подобного, наследственная молекула должна очень быстро залечиваться. Сначала мы предположили, что делящиеся эмбриональные клетки должны иметь несколько равноценных способов устранения одного и того же повреждения. Таким способом одновременно восстанавливалась бы структура ДНК на всех поврежденных участках, и процесс успешно завершался бы даже в том случае, если другие пути репарации подавлены по какой-либо причине. Но вместо того, чтобы экспериментально подтвердить свое предположение, мы обнаружили неизвестный ранее вид репарации ДНК. Работая с эмбрионами и яйцеклетками вьюна (костистой рыбы), мы неожиданно столкнулись с самостоятельной застройкой довольно крупных брешей (до 10-13 нуклеотидов) ДНК-полимеразой d - тем самым ферментом, который, как только что упоминалось, не может обходиться без помощника PCNA. Но в эмбриональном периоде вьюна полимераза d в помощнике не нуждалась. Оказалось, что этот фермент способен связываться одновременно с обоими концами разорванной ДНК и прочно удерживаться там, пока не “залатает дырку” полностью. Этот механизм репарации ДНК в эмбриональных активно делящихся клетках ранее не был известен. Между тем он очень важен, особенно если учесть, что большой заплатой устраняется основное число возникших в ДНК дефектов. Открытый нами способ репарации уникален тем, что действует в экстремальных условиях: совсем без белка-помощника или при его незначительном количестве, а также в том случае, когда в клетке не хватает других ДНК-полимераз, которые обходятся без PCNA.

Не дырка, а затяжка. Ультрафиолетовые лучи вызывают ковалентное сшивание соседних пиримидинов (например, тиминов) в молекуле ДНК. В распознавании и вырезании образовавшихся циклобутановых димеров участвуют семь белков - продуктов генов семейства ХР (XPA-XPG). У человека мутации хотя бы в одном из них могут привести к возникновению наследственного заболевания - пигментной ксеродермы (xeroderma pigmentosum, ХР), которая проявляется в первые годы жизни ребенка. На не защищенных от солнечных лучей участках кожи появляются пигментные пятна и в конце концов может развиться рак кожи.

Зачем нужно так много белков, и как они действуют? Каждый из них играет строго определенную роль. Белок ХРА узнает пиримидиновый димер в ДНК и связывается с другими членами семейства. ХРВ и XPD входят в состав сложного белкового комплекса - фактора транскрипции IIH (TFIIH), который расплетает ДНК в участке, подлежащем вырезанию. Еще один белок - ХРС - удерживает этот комплекс на поврежденном участке ДНК, а два последних (их называют нуклеазами вырезания) - XPF и XPG - работают как ножницы. Первая нуклеаза разрезает 24-ю фосфодиэфирную связь с 5ў -стороны от димера, а вторая - 5-ю связь с 3ў -стороны. В результате их совместного действия образуется разрыв длиной примерно в 30 нуклеотидов .

Заделывают такую большую брешь ДНК-полимеразы d или e , но им нужен помощник PCNA. Более того, для работы первого фермента необходим еще один белок - репликативный фактор С (RFC). В присутствии АТФ он связывается с концом цепи ДНК, который подходит к бреши с 5ў -стороны, затем присоединяется PCNA и образуется нестабильный тройной комплекс. После гидролиза АТФ конформация репликативного фактора меняется так, чтобы удерживать PCNA будто раскрытыми пальцами. Сам же этот помощник за счет временного размыкания своей кольцевой формы насаживается на дуплекс ДНК. К образовавшемуся стабильному комплексу присоединяется ДНК-полимераза d , которая и застраивает большую брешь. Сходным образом работает комплекс с участием ДНК-полимеразы e . Как видно, в устранении объемных повреждений участников много, да и сам процесс довольно сложен.

Если в клетках гены активно транскрибируются (т.е. синтезируется матричная РНК), восстановление по типу вырезания нуклеотида протекает намного быстрее благодаря включению в процесс еще двух белков - CSA и CSB. У человека мутации в генах этих белков вызывают наследственное заболевание - синдром Кокэйна (Cockayne’s syndrom, CS), при котором замедляется рост, повышается фоточувствительность, возникают катаракта, кариес зубов и дерматозы. Если во время транскрипции осуществляющая ее РНК-полимераза II наталкивается на повреждение в ДНК, то связывается с белками CSA и CSB. Тогда быстрая доставка ферментов репарации к месту поломки гарантирована, они залатают прореху, после чего транскрипция может завершиться.

Ткацкие ошибки. Ошибки репликации и рекомбинация (обмен участками) между аллелями могут привести к появлению неспаренных нуклеотидов в цепи ДНК. Для устранения таких неполадок существует особый тип репарации - исправление ошибок спаривания (mismatch repair, MMR). Самый простой путь их коррекции - немедленно удалить неправильно встроенный нуклеотид с помощью все тех же ДНК-полимераз d или e (правда, с дополнительной - экзонуклеазной - активностью). Более сложный вариант осуществляют, совместно действуя, ферменты, которые способны вырезать поврежденный участок (ферменты эксцизионной репарации), и группа дополнительных белков. Они узнают одиночный неспаренный нуклеотид или петли длиной до четырех нуклеотидов. (Мутации генов этих белков у человека вызывают предрасположенность к раковым заболеваниям.) Как только дефект обнаружен, нуклеазы удаляют его вместе с 50-500 нуклеотидами с каждой стороны . Огромную брешь застраивают те же полимеразы, зависимые от PCNA и потому способные синтезировать длинные фрагменты ДНК.

Регуляция. PCNA (о нем уже шла речь как о помощнике в репарации) и белок 53 (р53) - главные регуляторы в клетке, ответственные за ее судьбу. Первый белок, PCNA, участвует в репликации, второй - р53 - в транскрипции. А что делают эти белки, если во время копирования ДНК возникло повреждение, устранить которое должна ДНК-полимераза d ? Белок 53 стимулирует синтез белка 21, а тот тормозит копирование ДНК и прохождение клеточного цикла. За время остановки репликации клетка успевает избавиться от дефекта. Как такое может быть, ведь репликация и репарация - это всегда синтез ДНК, в котором задействован один и тот же белок PCNA? Репликация останавливается из-за того, что р21 связывается с PCNA, значит, на репарацию его не будет хватать. Но нет: в области повреждения создается избыток PCNA, и оно успешно ликвидируется.

Некоторые ученые полагают, что при повышенном содержании р21 ресинтез ведет не полимераза d , а полимераза b , которая не чувствительна к действию р21. Мы же, исходя из наших результатов, предполагаем, что смены ферментов не происходит, а просто ДНК-полимераза d переключается с зависимого от PCNA заполнения брешей на независимый от этого белка синтез ДНК .

Когда структура ДНК восстановлена, ряд белков-регуляторов и ферментов, участвовавших в репарации, подвергаются гидролизу, который осуществляет 26S протеасома . К таким белкам относится, например, белок XPC. Кроме того, сама протеасома или входящий в ее состав регуляторный комплекс 19S могут играть роль молекулярных шаперонов, способствуя приобретению репаративными белками нужной конформации. В этом случае протеасома стимулирует коррекцию ДНК.

Сквозные разрывы

Сквозные разрывы в молекуле ДНК - это результат ионизирующего облучения, окисления или механического повреждения. Такие же поломки возможны в тех случаях, когда во время репликации на пути ДНК-полимераз встречается разрыв в одной цепи. Но двухцепочечные разрывы могут быть и промежуточными продуктами нормальных биологических процессов (например, рекомбинации в развивающихся лимфоидных клетках). Если клетка не может заштопать сквозные разрывы, это приведет к дестабилизации генома, мутациям и возникновению раковых опухолей, а иногда к запуску апоптоза (запрограммированной гибели клетки). У эукариот существует два основных способа устранить двухцепочечные разрывы: гомологичная рекомбинация (рекомбинационная репарация) и соединение негомологичных концов.

Последовательность реконструкции ДНК, в которой разорваны обе цепи, способом гомологичной рекомбинации (слева ) и соединением негомологичных концов.
Первый способ восстановления ДНК характерен для дрожжей (Saccharomyces cerevisiae ), второй - для млекопитающих, в том числе для человека.
Объяснения в тексте.

Если имеется гомологичный дуплекс ДНК, последовательность которого комплементарна хотя бы одному разорванному концу, возможна рекомбинационная репарация. У дрожжей Saccharomyces cerevisiae это основной вариант, и зависит он от белка RAD52, а в случае мутаций гена Rad52 соединяются негомологичные концы, т.е. включается второй вариант репарации. У млекопитающих, напротив, второй способ главным образом и работает, а у дрозофилы оба пути равнозначны . Независимо от варианта репарации фрагменты разной длины просто вырезаются, последующее их восстановление не предусмотрено. Естественно, при этом нарушается первичная структура ДНК и теряется закодированная в удаленных участках информация. Но поскольку двухцепочечные разрывы сравнительно редки, клетке, по всей видимости, выгоднее пойти на такие жертвы, чем оставить ДНК разорванной.

Гомологичный обмен. Белок RAD52, от которого зависит рекомбинационная репарация у дрожжей, связывается, как только что упоминалось, с выступающими концами разорванных цепей ДНК, чем защищает их от действия экзонуклеаз. Затем RAD52 стимулирует присоединение белка RAD51 к тем местам, где находился сам. После этого один конец или оба внедряются в гомологичный дуплекс ДНК и происходит рекомбинация. Выступавшие из “прорехи” части ДНК вырезаются, и образовавшаяся брешь застраивается сразу с противоположных сторон, т.е. синтез фрагментов идет навстречу друг другу. В клетках дрожжей S.cerevisiae его осуществляют полимеразы d и e , которые нуждаются в PCNA и репликативном факторе (RFC), чтобы удержаться на оборванном конце ДНК и вести синтез. Правда, в застраивании бреши участвует еще и ДНК-полимераза a , единственная из многочисленных полимераз, способная инициировать синтез ДНК в репликативной вилке - там, где начинают расплетаться нити. Учитывая участие этого фермента в репарации сквозных разрывов ДНК, А.Холмс и Дж.Хэйбер предложили модель, по которой внедрение одного из разорванных концов в гомологичный дуплекс ДНК создает необычную репликативную вилку, где и синтезируются цепи . Репликация завершается, когда второй конец достигает разрыва. Оказавшийся лишним “повисший” концевой участок второй цепи удаляется нуклеазой.

С гомологичной рекомбинацией связан еще один способ латания мест разлома. Разорванные концы ДНК по кусочку отрезаются специфической экзонуклеазой в обоих направлениях от разрыва до тех пор, пока не откроются комплементарные последовательности. Затем следует отжиг (спаривание) комплементарных участков и подрезание “висящих” негомологичных хвостов ДНК. Этот путь репарации также зависит от белка RAD52.

Соединение негомологичных концов. Починка этим способом ДНК, разорванной в обеих цепях, обеспечивается целым набором белков. Это белок Ku и комплекс, образованный ДНК-лигазой IV и продуктом гена XRCC4 . Все они консервативны у эукариот, включая дрожжи и млекопитающих. Несмотря на то, что в ходе репарации порванные концы соединяются напрямую, без использования матрицы для синтеза, процесс должен быть максимально аккуратным и точным. Для выполнения этого требования служит белок Ku, который представляет собой гетеродимер из субъединиц Ku70 и Ku80 (молекулярная масса 70 и 80 кДа соответственно). Недавно была исследована кристаллическая структура человеческого гетеродимера, а также структура его комплекса с фрагментом ДНК в 55 нуклеотидов. Оказалось, что гетеродимер Ku кольцом обвивается вокруг дуплекса ДНК, но при этом не контактирует с основаниями ДНК, а образует несколько связей с сахарофосфатным остовом и подгоняется пространственно к виткам спирали ДНК так, чтобы они расположились в кольце белка строго определенным образом. Такая конфигурация комплекса Ku и ДНК, очевидно, необходима для поддержания той структуры выступающих оборванных концов, которая пригодна для следующих этапов репарации.

А их несколько. Сначала на оборванные концы ДНК “надевается” по гетеродимеру, затем они связываются друг с другом, образуя мостик. Именно к нему присоединяются и выполняют свои функции остальные участники: ДНК-полимераза заполняет бреши, образовавшиеся в результате соединения негомологичных концов ДНК; нуклеаза подрезает выступающие концы, если они оказались излишне длинными; лигаза IV сшивает восстановленные фрагменты в единое целое. У некоторых эукариот обнаружена ДНК-полимераза m, которая, видимо, и заполняет бреши в ДНК.

Когда сшиты цепи

Некоторые химические агенты, например, лекарства против рака (цисплатин, митомицин, псорален), вызывают образование межцепочечных сшивок ДНК . Такие неполадки эукариоты способны устранять, но механизмы репарации недостаточно ясны. Известно, что у почкующихся дрожжей S.cerevisiae она зависит от ферментных систем, обеспечивающих, например, удаление тиминовых димеров (о чем уже было сказано), и от рекомбинации. Эта же ферментная система из семи белков (ХРА-XPG) работает, как мы уже отмечали, и при исправлении человеческой ДНК со сшитыми цепочками. Только происходит все еще сложнее. Вспомним: один из белков, XPF, разрезает цепь ДНК с 5ў -стороны от повреждения на расстоянии 20(±5) нуклеотидов, другой, XPG, - с 3ў -стороны через 6(±3) нуклеотидов от димера. Однако в ДНК человека эти эндонуклеазы вырезают 22-28 нуклеотидов в одной цепи ДНК и лишь с одной стороны от сшивки, не затрагивая сам дефект. Почему же человеческая нуклеаза не разрезает цепь обычным образом, с обеих сторон от повреждения? Потому, полагают исследователи, что перед разрезанием двойная спираль должна быть расплетена (для этого служит фермент геликаза). Но расплести дуплекс она может не по соседству со сшивкой, а на отдалении от нее - на расстоянии 20(±5) нуклеотидов с 5ў -стороны. Расплетенный участок приобретает вид пузыря. Тогда-то одна эндонуклеаза, XPG, рвет цепь на положенном ей месте (т.е. ближе к дефекту), а другая, XPF, - приблизительно 27-ю фосфодиэфирную связь с 5ў -стороны от сшивки . Но это всего лишь первый этап репарации ДНК с межцепочечными сшивками.

Что же дальше? По одной из разработанных гипотетических моделей, дальше следует рекомбинация гомологичного дуплекса ДНК. Именно большая брешь в 22-28 нуклеотидов инициирует этот процесс. Но на стадии переноса цепи он блокируется, после чего специфическая эндонуклеаза разрезает ту же нить с другой стороны сшивки. Вновь образовавшийся интермедиат узнают компоненты “молекулярных ножниц” (системы эксцизионной репарации), и осуществляется второй раунд разрезания, теперь уже двойного, во второй нити. В результате высвобождаются сшитые олигомеры, и рекомбинация завершается. Таким образом, одна цепь оказывается репарированной рекомбинацией. Брешь во второй цепи застраивается ДНК-полимеразой с использованием первой в качестве матрицы.

Интересно отметить, что недавно у высших эукариот обнаружен белок, содержащий домены геликазы и ДНК-полимеразы. Мутации его гена значительно повышают чувствительность организма к агентам, вызывающим сшивки между цепочками ДНК. А поскольку и геликазная, и полимеразная активности необходимы на определенных этапах восстановления сшитой ДНК за счет рекомбинации, был сделан вывод об участии этого белка в таком репарационном процессе. Впоследствии уникальный белок назвали ДНК-полимеразой q.

Гипотетическая схема устранения межцепочечных сшивок ДНК.
Объяснения в тексте.

Если повреждение не удалено

Итак, повреждения ДНК у эукариот бывают разнообразными. И хотя существуют эффективные механизмы устранения таких дефектов, иногда клетка не способна удалить их все до единого по тем или иным причинам. В этом случае на поврежденных участках матрицы репликация ДНК останавливается. До недавнего времени было непонятно, каким же образом осуществляется копирование ДНК на поврежденных участках, не устраняемых известными способами. Это выяснилось совсем недавно.

В последние несколько лет открыта новая группа ДНК-полимераз - z, h, k, i, m, REV1, - которая как раз и предназначена для избавления от подобных повреждений . Полимеразы z, h и m осуществляют ресинтез ДНК, если в ней оказались неустраненными циклобутановые димеры между соседними тиминами; два последние фермента, а также полимеразы k и REV1 - при сохранении окисленного гуанина и апуриновых сайтов, а полимераза REV1 успешно застраивает еще и места с О(6)-метилгуанином. Интересно, что z -полимераза “работает в паре” с полимеразой h или REV1, продлевая на несколько нуклеотидов пройденный ими поврежденный участок ДНК.

Перечисленные полимеразы во время репликации ДНК иногда встраивают правильные нуклеотиды против поврежденных участков матрицы, при этом структура ДНК не нарушается. В некоторых же случаях включаются ошибочные нуклеотиды, и тогда возникают мутации. В настоящее время новой группе ДНК-полимераз уделяется особое внимание, так как клеткам необходим энзиматический аппарат, способный синтезировать ДНК в ситуациях, когда репарация вырезанием неэффективна или невозможна, а риск накопления мутаций оправдан.

* * * Первоначально механизм, предназначенный для устранения повреждений в ДНК, видимо, возник вместе с клеткой. По мере эволюции организмов он усложнялся, появлялись новые варианты. Насколько важен такой механизм, можно судить по тому, что в устранении поломок ДНК задействовано несколько десятков генов, и на производство ферментов репарации клетка тратит большую часть своих ресурсов. Надежность сохранения нуклеотидных последовательностей ДНК у высших эукариот очень велика: например, в геноме млекопитающего, насчитывающем около 3 млрд пар оснований, в клетках зародышевого пути за год подвергаются заменам лишь 10-20 оснований, а ведь повреждаются тысячи нуклеотидов. Особой надежности требует эмбриональный период: когда клетки активно делятся, необходимо как можно быстрее починить многочисленные поломки и сохранить генетическую информацию неповрежденной. Системы, благодаря которым восстанавливается природная структура ДНК, не только защищают геном от всевозможных повреждений, но и обслуживают генетические процессы в клетке. И если по какой-либо причине нарушен сам процесс репарации, это может обернуться серьезными неприятностями для клеток и всего организма. Так возникают повышенная предрасположенность к тем или иным заболеваниям, вплоть до онкологических, и тяжелые наследственные болезни. Знание механизмов, приводящих к различным заболеваниям, крайне необходимо практической медицине, чтобы облегчить поиск путей их лечения. И уж конечно, знание устраняет очередной пробел в постижении мира, будь он даже молекулярным.

Работа поддержана Российским фондом фундаментальных исследований. Проекты 00-04-49183, 03-04-49127.

Литература

1. Sharova N.P., Abramova E.B., Dmitrieva S.B., et al. // FEBS Lett. 2000. V.486. P.14-18.

2. Sancar A. // Annu. Rev. Biochem. 1996. V.65. P.43-81.

3. Wood R.D., Shivji M.K.K. // Carcinogenesis. 1997. V.18. P.605-610.

4. Абрамова Е.Б., Шарова Н.П., Карпов В.Л. // Мол. биология. 2002. Т.36. С.761-776.

5. Sekelsky J.J., Burtis K.C., Hawley R.S. // Genetics. 1998. V.148. P.1587-1598.

6. Holmes A.M., and Haber J.E. // Cell. 1999. V.96. P.415-424.

7. Haber J.E. // Trends Genet. 2000. V.16. P.259-264.

8. Kohn K.W. // Cancer Res. 1996. V.56. P.5533-5546.

9. Besshno T., Mu D., and Sancar A. // Mol. Cell. Biol. 1997. V.17. P.6822-6830.

10. Burgers P.M.J., Koonin E.V., Bruford E., et al. // J. Biol. Chem. 2001. V.276. P.43487-43490.