Мир современных материалов - оптический микроскоп. Отличия между цифровыми микроскопами и оптическими Из каких основных элементов состоит микроскоп

Оптической микроскопией называют совокупность методов наблюдения и исследования частиц анализируемых образцов лекарственных средств, невидимых невооруженным глазом, с помощью оптического микроскопа.

Размер частиц, которые могут быть исследованы данным методом, определяется разрешающей способностью микроскопа и обычно составляет 1 мкм и более. Однако при необходимости могут быть использованы микроскопы с общим увеличением более 1500, что позволяет характеризовать объекты размером от 0,5 мкм с разрешением отдельных структур объекта до 0,1 мкм.

Область применения

В фармакопейном анализе оптическую микроскопию применяют для определения размера частиц при контроле качества мягких лекарственных форм, суспензий, эмульсий, аэрозолей; в технологии лекарственных форм – для определения степени измельчения субстанций и вспомогательных веществ, а также для исследования кристаллических субстанций, так как форма, окраска и размер кристаллов являются индивидуальными характеристиками вещества.

Оборудование

Обычно оптический микроскоп имеет двухступенчатую систему увеличения, образованную объективом и окуляром.

Все узлы микроскопа монтируются на массивном основании. На основании установлен тубусодержатель, в котором укреплен тубус с объективом и окуляром. Под объективом находится предметный столик, под которым расположена осветительная система (зеркало, коллектор, конденсор). Для освещения объекта наблюдения может быть использован как естественный свет, так и специальные источники света (встроенный или внешние осветители).

Микроскоп может быть снабжен дополнительными приспособлениями(фазово-контрастными устройствами, конденсорами темного поля, поляризаторами, анализаторами и др.) и, в зависимости от выбранного метода наблюдения, может быть светлопольным, темнопольным, фазово-контрастным, поляризационным и др.

Испытуемый объект помещают на предметный столик. Свет от источника света, проходя через осветительную систему, испытуемый объект и объектив, попадает в окуляр или установленную вместо него систему регистрации, фото- или видеокамеру. Через окуляр осуществляют визуальное исследование объекта, а соединенная с компьютером цифровая фото- или видеокамера позволяет регистрировать изображения объекта, после чего их можно обрабатывать по специальным программам в полу- или полностью автоматическом режиме.

Увеличение микроскопа (произведение увеличений объектива, окуляра и дополнительных приставок) должно быть достаточным для адекватного описания и определения размеров самых мелких частиц образца.

Для каждого диапазона увеличения следует выбирать максимальную числовую апертуру объектива. Для контроля контрастности и детализации изображения окрашенных объектов рекомендуется использовать цветные фильтры с относительно узким спектром пропускания. Цветные фильтры могут применяться и для ахроматических (бесцветных) объектов.

Настройку всех элементов оптической системы, фокусировку и калибровку проводят в соответствии с прилагаемой к микроскопу

инструкцией.

Пробоподготовка

Испытуемые образцы можно исследовать как без использования, так и с использованием иммерсионной жидкости. Природа применяемой иммерсионной жидкости в значительной степени определяется физическими свойствами испытуемого образца, который не должен в ней растворяться. Если нет других указаний, в качестве иммерсионной жидкости при исследовании фармацевтических субстанций и вспомогательных веществ используют минеральное масло.

Частицы порошка должны находиться в одной плоскости и должны быть диспергированы так, чтобы были видны отдельные частицы (недопустимо слипание частиц).

Кроме того, при приготовлении образца для микроскопии (в том числе, при диспергировании в иммерсионной жидкости) должны быть сохранены первоначальный размер частиц и их распределение по размерам, свойственные испытуемому образцу.

Лекарственные формы анализируют без разведения или разводят, как указано в фармакопейной статье.

Микроскоп - оптический прибор для получения увеличенных изображений объектов (или деталей их структуры), невидимых невооружённым глазом.

Микроскоп применяют для получения больших увеличений при наблюдении мелких предметов. Увеличенное изображение предмета в микроскопе получается с помощью оптической системы, состоящей из двух короткофокусных линз - объектива O1 и окуляра O2. Объектив даст действительное перевернутое увеличенное изображение предмета. Это промежуточное изображение рассматривается глазом через окуляр, действие которого аналогично действию лупы. То есть изображение в микроскопе получается перевернутым. Окуляр располагают так, чтобы промежуточное изображение находилось в его фокальной плоскости; в этом случае лучи от каждой точки предмета распространяются после окуляра параллельным пучком.

Полезное увеличение микроскопа - такое увеличение, при котором предмет, имеющий размер, равный пределу разрешения микроскопа, имеет изображение, размер которого равен пределу разрешения глаза.

Полезное увеличение микроскопа находится в области 500 - 1000-кратной величины апертуры объектива. Нормальным увеличением микроскопа называется такое, которое получается при 500 А и диаметре зрачка выхода, равном 1 мм.

Полезное увеличение микроскопа в среднем равно 1000-кратному.

Полезное увеличение микроскопа определяется увеличением объектива, поэтому на совершенствование объективов обращается серьезное внимание.

Полезное увеличение N микроскопа должно быть подобрано так, чтобы при этом была рациональным образом использована разрешающая сила объектива микроскопа. Для этого необходимо, чтобы угловая величина изображения наблюдаемой детали по отношению к центру зрачка глаза была бы не меньше 2 минут, а еще лучше, как принято считать, доходила бы до 4 минут, что обусловлено разрешающей способностью глаза.

23. Разрешающая способность и предел разрешения микроскопа. Пути повышения разрешающей способности.

Одной из важнейших характеристик микроскопа является его разрешающая способность . Разрешение - способность оптического прибора воспроизводить изображение близко расположенных объектов. Линейный предел разрешения микроскопа, то есть минимальное расстояние между точками предмета, которые изображаются как раздельные, зависит от длины волны и числовой апертуры микроскопа:

Апертура - характеристика оптического прибора, описывающая его способность собирать свет и противостоять дифракционному размытию деталей изображения.

A = nSin(α/2), где n - показатель преломления той среды, в которой находится предмет и из которой исходят лучи, а α - угол, составляемый крайними лучами, идущими из предмета и попадающими еще в объектив.

Повысить разрешающую способность микроскопа можно двумя способами: либо увеличивая апертуру объектива, либо уменьшая длину волны света, освещающего препарат.

24.Специальные методы микроскопии: метод темного поля, поляризационный, люминесцентный микроскоп.

Метод исследования в темном поле впервые был предложен австрийскими

учеными Р. Зигмонди и Р. Зидентопфом в 1903 году и подходит для

рассеивающих свет объектов.

В основе метода лежит освещение препарата полым конусом света,

внутренняя апертура которого превосходит числовую апертуру применяемого

объектива. Поскольку ни один прямой луч от

осветителя в объектив попасть не может, при

отсутствии объекта поле зрения микроскопа

будет темным. Объект, помещенный на

предметный столик, будет рассеивать свет во

все стороны, в том числе и в сторону объектива,

благодаря чему на темном фоне будет видно

контрастное изображение объекта.

В микроскопе проходящего света тип

освещения создается посредством кольцевой

диафрагмы в конденсоре (рис. 8). В случае,

когда в исследованиях используется объектив с

высокой числовой апертурой, есть вероятность,

что часть света все же будет попадать объектив.

По этой причине используются

специализированные объективы, имеющие

встроенную внутреннюю ирисовую диафрагму,

которая позволяет уменьшать эффективное значение NAobj до величины,

достаточной для наблюдения в темном поле.

Поляризационная микроскопия – это метод наблюдения в поляризованном свете для микроскопического исследования препаратов, включающих оптически анизотропные элементы (или целиком состоящих из таких элементов). Таковыми являются многие минералы, зёрна в шлифах сплавов, некоторые животные и растительные ткани и пр. Оптические свойства анизотропных микрообъектов различны в различных направлениях и проявляются по-разному в зависимости от ориентации этих объектов относительно направления наблюдения и плоскости поляризации света, падающего на них. Наблюдение можно проводить как в проходящем, так и в отражённом свете. Свет, излучаемый осветителем, пропускают через поляризатор. Сообщенная ему при этом поляризация меняется при последующем прохождении света через препарат (или отражении от него). Эти изменения изучаются с помощью анализатора и различных оптических компенсаторов. Анализируя такие изменения, можно судить об основных оптических характеристиках анизотропных микрообъектов: силе двойного лучепреломления, количестве оптических осей и их ориентации, вращении плоскости поляризации, дихроизме.

Метод исследования в свете люминесценции (люминесцентная микроскопия, или флуоресцентная микроскопия) состоит в наблюдении под микроскопом зелено-оранжевого свечения микрообъектов, которое возникает при их освещении сине-фиолетовым светом или не видимыми глазом ультрафиолетовыми лучами. В оптическую схему микроскопа вводятся два светофильтра. Один из них помещают перед конденсором. Он пропускает от источника-осветителя излучение только тех длин волн, которые возбуждают люминесценцию либо самого объекта (собственная люминесценция), либо специальных красителей, введённых в препарат и поглощённых его частицами (вторичная люминесценция). Второй светофильтр, который установлен после объектива, пропускает к глазу наблюдателя (или на фоточувствительный слой) только свет люминесценции. В люминесцентной микроскопии используют освещение препаратов как сверху (через объектив, который в этом случае служит и конденсором), так и снизу, через обычный конденсор. Наблюдение при освещении сверху иногда называют «люминесцентной микроскопией в отражённом свете» (этот термин условен - возбуждение свечения препарата не является простым отражением света). Его часто используют совместно с наблюдением по фазово-контрастному методу в проходящем свете. Метод нашел широкое применение в микробиологии, вирусологии, гистологии, цитологии, в пищевой промышленности, при исследовании почв, в микрохимическом анализе, в дефектоскопии. Такое многообразие применений объясняется очень высокой цветовой чувствительностью глаза и высокой контрастностью изображения самосветящегося объекта на тёмном нелюминесцирующем фоне. Кроме того, информация о составе и свойствах исследуемых веществ, которую можно получить, зная интенсивность и спектральный состав их люминесцентного излучения, имеет огромную ценность.

Как известно, основную долю информации об окружающем мире человек получает с помощью зрения. Глаз человека - сложный и совершенный прибор. Этот созданный природой прибор работает со светом - электромагнитным излучением, диапазон длин волн которого находится между 400 и 760 нанометрами. Цвет, который при этом воспринимает человек, изменяется от фиолетового до красного.

Электромагнитные волны, соответствующие видимому свету, взаимодействуют с электронными оболочками атомов и молекул глаза. Результат этого взаимодействия зависит от того, в каком состоянии находятся электроны этих оболочек. Свет может поглощаться, отражаться или рассеиваться. Что именно произошло со светом, может многое рассказать об атомах и молекулах, с которыми он взаимодействовал. Диапазон размеров атомов и молекул от 0,1 до десятков нанометров. Это во много раз меньше, чем длина волны света. Тем не менее, объекты именно таких размеров - назовем их нанообъектами - очень важно увидеть. Что же надо для этого сделать? Обсудим сначала, что может рассмотреть человеческий глаз.

Обычно, когда говорят о разрешающей способности того или иного оптического прибора, оперируют двумя понятиями. Одно из них - угловое разрешение, а второе - линейное разрешение. Эти понятия взаимосвязаны. К примеру, для человеческого глаза угловое разрешение составляет приблизительно 1 угловую минуту. При этом глаз может различить два точечных объекта, удаленных от него на 25–30 см, только тогда, когда расстояние между этими объектами больше чем 0,075 мм. Это вполне сравнимо с разрешением обычного компьютерного сканера. В самом деле, разрешение 600 точек на дюйм означает, что сканер может различить точки, расположенные на расстоянии 0,042 мм друг от друга.

Для того чтобы можно было различать объекты, расположенные на еще меньших расстояниях друг от друга, был придуман оптический микроскоп - прибор, увеличивающий разрешающую способность глаза. Выглядят эти приборы по-разному (что видно из рисунка 1), но принцип действия у них один тот же. Оптический микроскоп позволил отодвинуть предел разрешения до долей микрона. Уже 100 лет назад оптическая микроскопия сделала возможным изучать объекты микронных размеров. Однако тогда же стало ясно, что простым увеличением количества линз и улучшением их качества добиться дальнейшего увеличения разрешающей способности невозможно. Разрешение оптического микроскопа оказалось ограничено свойствами самого света, а именно его волновой природой.

Еще в конце позапрошлого века было установлено, что разрешение оптического микроскопа составляет . В этой формуле λ - длина волны света, а n sin u - числовая апертура объектива микроскопа, которая характеризует как микроскоп, так и то вещество, которое находится между объектом изучения и самой близкой к нему линзой микроскопа. И действительно, в выражение для числовой апертуры входят показатель преломления n среды, находящейся между объектом и объективом, и угол u между оптической осью объектива и самыми крайними лучами, которые выходят из объекта и могут попасть в этот объектив. Показатель преломления вакуума равен единице. У воздуха этот показатель очень близок к единице, у воды он составляет 1,33303, а у специальных жидкостей, используемых в микроскопии для получения максимального разрешения, n доходит до 1,78. Каким бы ни был угол u , величина sin u не может быть больше единицы. Таким образом, разрешение оптического микроскопа не превышает долей длины волны света.

Обычно считается, что разрешение составляет половину длины волны.

Интенсивность, разрешение и увеличение объекта - разные вещи. Можно сделать так, что расстояние между центрами изображений объектов, которые расположены в 10 нм друг от друга, будет 1 мм. Это будет соответствовать увеличению в 100 000 раз. Тем не менее, различить, один это объект или два, не получится. Дело в том, что изображения объектов, размеры которых очень малы по сравнению с длиной волны света, будут иметь одинаковые форму и размеры, не зависящие от формы самих объектов. Такие объекты называют точечными - их размерами можно пренебречь. Если такой точечный объект светится, то оптический микроскоп изобразит его в виде светлого кружка, окруженного светлыми и темными кольцами. Будем далее, для простоты, рассматривать именно источники света. Типичное изображение точечного источника света, полученное с помощью оптического микроскопа, показано на рисунке 2. Интенсивность светлых колец намного меньше, чем у кружочка, и убывает по мере удаления от центра изображения. Чаще всего видно только первое светлое кольцо. Диаметр первого темного кольца равен . Функция, которая описывает такое распределение интенсивности, называется функцией рассеяния точки. Эта функция не зависит от того, каково увеличение. Изображение нескольких точечных объектов будет представлять собой именно круги и кольца, как это видно из рисунка 3. Полученное изображение можно увеличивать, однако если изображения двух соседних точечных объектов сливаются, то они будут сливаться и дальше. Такое увеличение часто называют бесполезным - большие изображения просто будут более размытыми. Пример бесполезного увеличения показан на рисунке 4. Формула часто называется дифракционным пределом, и она настолько знаменита, что именно ее высекли на памятнике автору этой формулы - немецкому физику-оптику Эрнсту Аббе.

Конечно, со временем оптические микроскопы стали снабжать разнообразными устройствами, позволяющими запоминать изображения. Человеческий глаз дополнили сначала пленочные фото- и кинокамеры, а потом - камеры, в основе которых лежат цифровые устройства, преобразующие попадающий на них свет в электрические сигналы. Самыми распространенными из таких устройств являются ПЗС-матрицы (ПЗС расшифровывается как прибор с зарядовой связью). Количество пикселей в цифровых камерах продолжает расти, однако само по себе это не может улучшить разрешение оптических микроскопов.

Еще двадцать пять лет назад казалось, что дифракционный предел непреодолим и что, для того чтобы изучать объекты, размеры которых во много раз меньше, чем длина волны света, необходимо отказаться от света как такового. Именно таким путем пошли создатели электронных и рентгеновских микроскопов. Несмотря на многочисленные преимущества таких микроскопов, задача использования именно света для рассматривания нанообъектов оставалась. Причин для этого было много: удобство и простота работы с объектами, небольшое время, которое требуется для получения изображения, известные способы окрашивания образцов и многое другое. Наконец, после долгих лет напряженной работы стало возможным рассматривать нанообъекты с помощью оптического микроскопа. Наибольший прогресс в этом направлении достигнут в области люминесцентной микроскопии. Конечно, дифракционный предел никто не отменял, но его удалось обойти. В настоящее время существуют различные оптические микроскопы, позволяющие рассматривать объекты, размеры которых намного меньше длины волны того самого света, который создает изображения этих объектов. Все эти приборы объединяет один общий принцип. Попробуем пояснить, какой именно.

Из того, что уже говорилось о дифракционном пределе разрешения, ясно, что увидеть точечный источник не так уж сложно. Если этот источник обладает достаточной интенсивностью, его изображение будет отчетливо видно. Форма и размер этого изображения, как уже говорилось, будут определяться свойствами оптической системы. При этом, зная свойства оптической системы и будучи уверенными в том, что объект точечный, можно определить, где именно находится объект. Точность определения координат такого объекта достаточно высока. Иллюстрацией этого может служить рисунок 5. Координаты точечного объекта можно определить тем точнее, чем интенсивнее он светится. Еще в 80-х годах прошлого века с помощью оптического микроскопа умели определять положение отдельных светящихся молекул с точностью в 10–20 нанометров. Необходимым условием столь точного определения координат точечного источника является его одиночество. Ближайший к нему другой точечный источник должен находиться настолько далеко, чтобы исследователь точно знал, что обрабатываемое изображение соответствует одному источнику. Понятно, что это расстояние l должно удовлетворять условию . В этом случае анализ изображения может дать очень точные данные о положении самого источника.

Большинство объектов, размеры которых намного меньше разрешающей способности оптического микроскопа, можно представить как набор точечных источников. Источники света в таком наборе находятся друг от друга на расстояниях, намного меньших величины . Если эти источники будут светить одновременно, то сказать что-либо о том, где именно они расположены, будет невозможно. Тем не менее, если суметь заставить эти источники светить по очереди, то положение каждого них можно определить с высокой точностью. Если эта точность превышает расстояние между источниками, то, обладая знанием о положении каждого из них, можно узнать о том, каково их взаимное расположение. А это означает, что получена информация о форме и размерах объекта, который представлен как набор точечных источников. Другими словами, в таком случае можно рассмотреть в оптический микроскоп объект, размеры которого меньше, чем дифракционный предел!

Таким образом, ключевым моментом является получение информации о различных частях нанообъекта независимо друг от друга. Существуют три основные группы методов, позволяющие сделать это.

Первая группа методов целенаправленно заставляет светить ту или иную часть исследуемого объекта. Самый известный из этих методов - сканирующая оптическая микроскопия ближнего поля. Рассмотрим ее подробнее.

Если внимательно изучить те условия, которые подразумеваются, когда речь идет о дифракционном пределе, обнаружится, что расстояния от объектов до линз значительно больше длины волны света. На расстояниях, сравнимых и меньших этой длины волны, картина получается другой. Вблизи любого объекта, попавшего в электромагнитное поле световой волны, существует переменное электромагнитное поле, частота изменения которого такая же, как частота изменения поля в световой волне. В отличие от световой волны, это поле быстро затухает по мере удаления от нанообъекта. Расстояние, на котором происходит уменьшение интенсивности, например, в e раз, сравнимо с размерами объекта. Таким образом, электромагнитное поле оптической частоты оказывается сконцентрированным в объеме пространства, размер которого намного меньше, чем длина волны света. Любой нанообъект, попавший в эту область, будет так или иначе взаимодействовать со сконцентрированным полем. Если тот объект, с помощью которого осуществляется это концентрирование поля, последовательно перемещать по какой-либо траектории вдоль изучаемого нанообъекта и регистрировать свет, излучаемый этой системой, то можно построить изображение по отдельным точкам, лежащим на этой траектории. Конечно, в каждой точке изображение будет выглядеть так, как показано на рисунке 2, но разрешение при этом будет определяться тем, насколько удалось сконцентрировать поле. А это, в свою очередь, определяется размерами того объекта, с помощью которого это поле концентрируется.

Самым распространенным способом такой концентрации поля является изготовление очень маленького отверстия в металлическом экране. Обычно это отверстие находится на конце заостренного и покрытого тонкой пленкой металла световода (световод часто называется оптическим волокном и широко используется для передачи данных на большие расстояния). Сейчас удается изготавливать отверстия с диаметрами от 30 до 100 нм. Таким же по величине получается и разрешение. Приборы, работающие по этому принципу, и называются сканирующими оптическими микроскопами ближнего поля. Они появились 25 лет тому назад.

Суть второй группы методов сводится к следующему. Вместо того чтобы заставлять соседние нанообъекты светить по очереди, можно использовать объекты, которые светятся разными цветами. В этом случае с помощью светофильтров, пропускающих свет того или иного цвета, можно определять положение каждого из объектов, а потом - составлять единую картину. Это очень похоже на то, что изображено на рисунке 5, только цвета для трех изображений будут различными.

Последняя группа методов, позволяющих преодолеть дифракционный предел и рассмотреть нанообъекты, использует свойства самих светящихся объектов. Существуют такие источники, которые можно «включать» и «выключать» с помощью специально подобранного света. Такие переключения происходят статистически. Иначе говоря, если имеется много переключаемых нанообъектов, то, подобрав длину волны света и его интенсивность, можно заставить «выключиться» только часть из этих объектов. Остальные объекты будут продолжать светить, и можно получить от них изображение. После этого надо «включить» все источники и снова «выключить» часть из них. Набор оставшихся «включенными» источников будет отличаться от набора, который остался «включенным» в первый раз. Повторяя такую процедуру много раз, можно получить большой набор изображений, отличающихся друг от друга. Анализируя такой набор, можно установить местоположение большой доли всех источников с очень высокой точностью, значительно превышающей дифракционный предел. Пример сверхразрешения, полученного таким способом, приведен на рисунке 6.

В настоящее время оптическая микроскопия со сверхразрешением быстро развивается. Можно со всей уверенностью предполагать, что в грядущие годы эта область будет привлекать все большее число исследователей, и хочется верить, что среди них будут и читатели этой статьи.

Микроскоп Гука

Реплика однолинзового микроскопа Левенгука

Невозможно точно определить, кто изобрёл микроскоп. Считается, что голландский мастер очков Ханс Янсен и его сын Захарий Янсен изобрели первый микроскоп в , но это было заявление самого Захария Янсена в середине XVII века . Дата, конечно, не точна, так как оказалось, что Захария родился около г. Другим претендентом на звание изобретателя микроскопа был Галилео Галилей . Он разработал «occhiolino» («оккиолино»), или составной микроскоп с выпуклой и вогнутой линзами в г. Галилей представил свой микроскоп публике в Академии деи Линчеи , основанной Федерико Чези в г. Изображение трёх пчел Франческо Стеллути было частью печати Папы Урбана VIII и считается первым опубликованным микроскопическим символом (см. «Stephen Jay Gould, The Lying stones of Marrakech, 2000»). Десятью годами позже Галилея Корнелиус Дреббель изобретает новый тип микроскопа, с двумя выпуклыми линзами. Кристиан Гюйгенс , другой голландец, изобрел простую двухлинзовую систему окуляров в конце 1600-х , которая ахроматически регулировалась и, следовательно, стала огромным шагом вперед в истории развития микроскопов. Окуляры Гюйгенса производятся и по сей день, но им не хватает широты поля обзора, а расположение окуляров неудобно для глаз по сравнению с современными широкообзорными окулярами. В 1665 году англичанин Роберт Гук сконструировал собственный микроскоп и опробовал его на пробке. В результате этого исследования появилось название «клетки». Антон Ван Левенгук ( -) считается первым, кто сумел привлечь к микроскопу внимание биологов, несмотря на то, что простые увеличительные линзы уже производились с 1500-х годов , а увеличительные свойства наполненных водой стеклянных сосудов упоминались ещё древними римлянами (Сенека). Изготовленные вручную, микроскопы Ван Левенгука представляли собой очень небольшие изделия с одной очень сильной линзой. Они были неудобны в использовании, однако позволяли очень детально рассматривать изображения лишь из-за того, что не перенимали недостатков составного микроскопа (несколько линз такого микроскопа удваивали дефекты изображения). Понадобилось около 150 лет развития оптики, чтобы составной микроскоп смог давать такое же качество изображения, как простые микроскопы Левенгука. Так что, хотя Антон Ван Левенгук был великим мастером микроскопа, он не был его изобретателем вопреки широко распространённому мнению.

Недавние достижения

В группе немецкого учёного Штефана Хелля (Stefan Hell) из Института Биофизической Химии научного сообщества Макса Планка (Гёттинген) в сотрудничестве с аргентинским учёным Мариано Босси (Mariano Bossi) в 2006 году был разработан оптический микроскоп под названием Наноскоп, позволяющий преодолевать барьер Аббе и наблюдать объекты размером около 10 нм (а на 2010 год и ещё меньше), оставаясь в диапазоне видимого излучения, получая при этом высококачественные трёхмерные изображения объектов, ранее недоступных для обычной световой и конфокальной микроскопии.

Применение

Устройство микроскопа

Оптическая система микроскопа состоит из основных элементов - объектива и окуляра. Они закреплены в подвижном тубусе, расположенном на металлическом основании, на котором имеется предметный столик. Увеличение оптического микроскопа без дополнительных линз между объективом и окуляром равно произведению их увеличений .

В современном микроскопе практически всегда есть осветительная система (в частности, конденсор с ирисовой диафрагмой), макро- и микро- винты для настройки резкости, система управления положением конденсора.

В зависимости от назначения, в специализированных микроскопах могут быть использованы дополнительные устройства и системы.

Объективы

Объектив микроскопа - микрообъектив представляет собой сложную оптическую систему, образующую увеличенное изображение объекта, и является основной и наиболее ответственной частью микроскопа. Микрообъектив создает действительное перевернутое изображение, которое рассматривается через окуляр

Иммерсия

Иммерсия в микроскопии - это введение между объективом микроскопа и рассматриваемым в нём предметом жидкости для усиления яркости и расширения пределов увеличения изображения .

Окуляры

Окуляры микроскопа Альтами 136

Окуля́р - обращённая к глазу часть микроскопа, предназначаемая для рассматривания с некоторым увеличением оптического изображения, даваемого объективом микроскопа.

Система освещения препарата

Система освещения с конденсором

В первых микроскопах исследователи вынуждены были пользоваться естественными источниками света. Для улучшения освещённости стали использовать зеркало, а затем - и вогнутое зеркало, с помощью которого на препарат направляли лучи солнца или лампы. В современных микроскопах освещение регулируют с помощью конденсора.

Конденсор

Конденсор тёмного поля

Конденсоры темного поля применяются в темнопольной оптической микроскопии . Лучи света направляются конденсором таким образом, что они не попадают напрямую во входное отверстие объектива. Изображение формируется светом, рассеивающимся на оптических неоднородностях образца. В ряде случаев метод позволяет исследовать структуру прозрачных объектов без их окрашивания. Разработан ряд конструкций конденсоров темного поля, имеющих линзовую или зеркально-линзовую оптическую схему.

Предметный столик

Предметный столик выполняет роль поверхности, на которой размещают микроскопический препарат. В разных конструкциях микроскопов столик может обеспечить координатное движение препарата в поле зрения объектива, по вертикали и горизонтали, или поворот препарата на заданный угол.

Вспомогательные приспособления

Предметные и покровные стёкла

Первые наблюдения в микроскоп производились непосредственно над каким-либо объектом (птичье перо, снежинки, кристаллы и т. п.). Для удобства наблюдения в проходящем свете, препарат стали размещать на стеклянной пластинке (предметное стекло). Позже препарат стали закреплять тонким покровным стеклом, что позволило создавать коллекции образцов, например, гистологические коллекции. Для исследования методом висячей капли используются предметные стекла с лункой - камеры Ранвье .

Счетные камеры

Для количественного учета клеток, взвешенных в какой-либо жидкости, используют счетные камеры - предметные стекла особой конструкции. В медицине для учета форменных элементов крови применяется камера Горяева .

Классификация

Рабочие лабораторные микроскопы

Бинокулярные микроскопы (микроскопы с бинокулярной насадкой)

Бинокулярный оптические микроскопы позволяет получать 2 изображения объекта, рассматриваемые под небольшим углом, что обеспечивает объёмное восприятие. Общее увеличение (объектив*окуляр) оптических микроскопов с бинокулярной насадкой обычно больше, чем у соответствующих монокулярных микроскопов.

Стереомикроскопы

Исследование с помощью компьютеризованного бинокулярного микроскопа

Учебный стереомикроскоп Альтами ПС II

Оптическая схема современного стереомикроскопа.
A - Объектив B - Галилеевы системы (поворачивающиеся объективы ) C - Регулятор увеличения D - Внутренний объектив E - Призма F - Оборачивающая система линз G - Окулярная сетка H - Окуляр

Стереомикроскопы, как и другие виды оптических микроскопов, позволяют работать как в проходящем, так и в отражённом свете . Обычно они имеют сменные окуляры бинокулярной насадки и один несменный объектив (есть и модели со сменными объективами). Большинство стереомикроскопов дает существенно меньшее увеличение, чем современные оптические микроскопы, однако имеет существенно большее фокусное расстояние, что позволяет рассматривать крупные объекты. Кроме того, в отличие от обычных оптических микроскопов, которые дают, как правило, инвертированное изображение, оптическая система стереомикроскопов не «переворачивает» изображение. Это позволяет широко использовать их для препарирования микроскопических объектов вручную или с использованием микроманипуляторов.

Наиболее широко бинокуляры используются для исследования неоднородностей поверхности твёрдых непрозрачных тел, таких как горные породы, металлы, ткани; в микрохирургии и пр.

Металлографические микроскопы

Специфика металлографического исследования заключается в необходимости наблюдать структуру поверхности непрозрачных тел. Поэтому микроскоп построен по схеме отраженного света, где имеется специальный осветитель установленный со стороны объектива. Система призм и зеркал направляет свет на объект, далее свет отражается от не прозрачного объекта и направляется обратно в объектив. "..

Современные прямые металлургические микроскопы характеризуются большим расстоянием между поверхностью столика и объективами и большим вертикальным ходом столика, что позволяет работать с крупными образцами. Максимальное расстояние может достигать десятки сантиметров . Но обычно в материаловедении используются инвертированные микроскопы, как не имеющие ограничения на размер образца (только на вес) и не требующие параллельности опорной и рабочей граней образца (в этом случае они совпадают).

Поляризационные микроскопы

В основе принципа действия поляризационных микроскопов лежит получение изображения исследуемого объекта при его облучении поляризованными лучами, которые в свою очередь должны быть получены из обычного света с помощью специального прибора - поляризатора. В сущности при прохождении поляризованного света через вещество либо отраженное от него меняет плоскость поляризации света в результате чего на втором поляризационном фильтре выявляется в виде излишнего затемнения. Либо дают специфичные реакции как двойное лучепреломление в жирах.

Электрическая часть микроскопа

В отличие от лупы, микроскоп имеет, как минимум, две ступени увеличения. Функциональные и конструктивно-технологические части микроскопа предназначены для обеспечения работы микроскопа и получения устойчивого, максимально точного, увеличенного изображения объекта. Здесь мы рассмотрим устройство микроскопа и постараемся описать основные части микроскопа.

Функционально устройство микроскопа делится на 3 части:

1. Осветительная часть

Осветительная часть конструкции микроскопа включает источник света (лампа и электрический блок питания) и оптико-механическую систему (коллектор, конденсор, полевая и апертурная регулируемые/ирисовые диафрагмы).

2. Воспроизводящая часть

Предназначена для воспроизведения объекта в плоскости изображения с требуемым для исследования качеством изображения и увеличения (т. е. для построения такого изображения, которое как можно точнее и во всех деталях воспроизводило бы объект с соответствующим оптике микроскопа разрешением, увеличением, контрастом и цветопередачей).
Воспроизводящая часть обеспечивает первую ступень увеличения и расположена после объекта до плоскости изображения микроскопа.
Воспроизводящая часть включает объектив и промежуточную оптическую систему.

Современные микроскопы последнего поколения базируются на оптических системах объективов, скорректированных на бесконечность. Это требует дополнительно применения так называемых тубусных систем, которые параллельные пучки света, выходящие из объектива, «собирают» в плоскости изображения микроскопа.

3. Визуализирующая часть

Предназначена для получения реального изображения объекта на сетчатке глаза, фотоплёнке или пластинке, на экране телевизионного или компьютерного монитора с дополнительным увеличением (вторая ступень увеличения).
Визуализирующая часть расположена между плоскостью изображения объектива и глазами наблюдателя (цифровой камерой).
Визуализирующая часть включает монокулярную, бинокулярную или тринокулярную визуальную насадку с наблюдательной системной (окулярами, которые работают как лупа).
Кроме того, к этой части относятся системы дополнительного увеличения (системы оптовара/смены увеличения); проекционные насадки, в том числе дискуссионные для двух и более наблюдателей; рисовальные аппараты; системы анализа и документирования изображения с соответствующими адаптерами для цифровых камер.

Схема расположения основных элементов оптического микроскопа

С конструктивно-технологической точки зрения, микроскоп состоит из следующих частей:

• механической;
• оптической;
• электрической.

1. Механическая часть микроскопа

Устройство микроскопа включается в себя штатив, который является основным конструктивно-механическим блоком микроскопа. Штатив включает в себя следующие основные блоки: основание и тубусодержатель .

Основание представляет собой блок, на котором крепится весь микроскоп и является одной из основных частей микроскопа. В простых микроскопах на основание устанавливают осветительные зеркала или накладные осветители. В более сложных моделях осветительная система встроена в основание без или с блоком питания.

Разновидности оснований микроскопа:

1. основание с осветительным зеркалом;
2. так называемое «критическое» или упрощенное освещение;
3. освещение по Келеру.

1. узел смены объективов, имеющий следующие варианты исполнения — револьверное устройство, резьбовое устройство для ввинчивания объектива, «салазки» для безрезьбового крепления объективов с помощью специальных направляющих;
2. фокусировочный механизм грубой и точной настройки микроскопа на резкость — механизм фокусировочного перемещения объективов или столиков;
3. узел крепления сменных предметных столиков;
4. узел крепления фокусировочного и центрировочного перемещения конденсора;
5. узел крепления сменных насадок (визуальных, фотографических, телевизионных, различных передающих устройств).

В микроскопах могут использоваться стойки для крепления узлов (например, фокусировочный механизм в стереомикроскопах или крепление осветителя в некоторых моделях инвертированных микроскопов).

Чисто механическим узлом микроскопа является предметный столик , предназначенный для крепления или фиксации в определенном положении объекта наблюдения. Столики бывают неподвижные, координатные и вращающиеся (центрируемые и нецентрируемые).

2. Оптика микроскопа (оптическая часть)

Оптические узлы и принадлежности обеспечивают основную функцию микроскопа — создание увеличенного изображения объекта с достаточной степенью достоверности по форме, соотношению размеров составляющих элементов и цвету. Кроме этого, оптика должна обеспечивать такое качество изображения, которое отвечает целям исследования и требованиям методик проводимого анализа.
Основными оптическими элементами микроскопа являются оптические элементы, образующие осветительную (в том числе, конденсор), наблюдательную (окуляры) и воспроизводящую (в том числе объективы) системы микроскопа.

Объективы микроскопа

— представляют собой оптические системы, предназначенные для построения микроскопического изображения в плоскости изображения с соответствующим увеличением, разрешением элементов, точностью воспроизведения по форме и цвету объекта исследования. Объективы являются одними из основных частей микроскопа. Они имеют сложную оптико-механическую конструкцию, которая включает несколько одиночных линз и компонентов, склеенных из 2-х или 3-х линз.
Количество линз обусловлено кругом решаемых объективом задач. Чем выше качество изображения, которое дает объектив, тем сложнее его оптическая схема. Общее число линз в сложном объективе может доходить до 14 (например, это может относиться к планапохроматическому объективу с увеличением 100х и числовой апертурой 1,40).

Объектив состоит из фронтальной и последующей частей. Фронтальная линза (или система линз) обращена к препарату и является основной при построении изображения соответствующего качества, определяет рабочее расстояние и числовую апертуру объектива. Последующая часть в сочетании с фронтальной обеспечивает требуемое увеличение, фокусное расстояние и качество изображения, а также определяет высоту объектива и длину тубуса микроскопа.

Классификация объективов

Классификация объективов значительно сложнее классификации микроскопов. Объективы разделяются по принципу расчетного качества изображения, параметрическим и конструктивно-технологическим признакам, а также по методам исследования и контрастирования.

По принципу расчетного качества изображения объективы могут быть:

• ахроматическими;
• апохроматическими;
• объективами плоского поля (план).

Ахроматические объективы .

Ахроматические объективы рассчитаны для применения в спектральном диапазоне 486-656 нм. Исправление любой аберрации (ахроматизация) выполнено для двух длин волн. В этих объективах устранены сферическая аберрация, хроматическая аберрация положения, кома, астигматизм и частично — сферохроматическая аберрация. Изображение объекта имеет несколько синевато-красноватый оттенок.

Апохроматические объективы .

Апохроматические объективы имеют расширенную спектральную область, и ахроматизация выполняется для трех длин волн. При этом, кроме хроматизма положения, сферической аберрации, комы и астигматизма, достаточно хорошо исправляются также вторичный спектр и сферохроматическая аберрация, благодаря введению в схему линз из кристаллов и специальных стекол. По сравнению с ахроматами, эти объективы обычно имеют повышенные числовые апертуры, дают четкое изображение и точно передают цвет объекта.

Полуапохроматы или микрофлюары .

Современные объективы, обладающие промежуточным качеством изображения.

Планобъективы .

В планобъективах исправлена кривизна изображения по полю, что обеспечивает резкое изображение объекта по всему полю наблюдения. Планобъективы обычно применяются при фотографировании, причем наиболее эффективно применение планапохроматов.

Потребность в подобного типа объективах возрастает, однако они достаточно дороги из-за оптической схемы, реализующей плоское поле изображения, и применяемых оптических сред. Поэтому рутинные и рабочие микроскопы комплектуются так называемыми экономичными объективами. К ним относятся объективы с улучшенным качеством изображения по полю: ахростигматы (LEICA), СР-ахроматы и ахропланы (CARL ZEISS), стигмахроматы (ЛОМО).

По параметрическим признакам объективы делятся следующим образом:

1. объективы с конечной длиной тубуса (например, 160 мм) и объективы, скорректированные на длину тубуса «бесконечность» (например, с дополнительной тубусной системой, имеющей фокусное расстояние микроскопа 160 мм);
2. объективы малых (до 10х); средних (до 50х) и больших (более 50х) увеличений, а также объективы со сверхбольшим увеличением (свыше 100х);
3. объективы малых (до 0,25), средних (до 0,65) и больших (более 0,65) числовых апертур, а также объективы с увеличенными (по сравнению с обычными) числовыми апертурами (например, объективы апохроматической коррекции, а также специальные объективы для люминесцентных микроскопов);
4. объективы с увеличенными (по сравнению с обычными) рабочими расстояниями, а также с большими и сверхбольшими рабочими расстояниями (объективы для работы в инвертированных микроскопах). Рабочее расстояние — это свободное расстояние между объектом (плоскостью покровного стекла) и нижним краем оправы (линзы, если она выступает) фронтального компонента объектива;
5. объективы, обеспечивающие наблюдение в пределах нормального линейного поля (до 18 мм); широкопольные объективы (до 22,5 мм); сверхширокопольные объективы (более 22,5 мм);
6. объективы стандартные (45 мм, 33 мм) и нестандартные по высоте.

Высота — расстояние от опорной плоскости объектива (плоскости соприкосновения ввинченного объектива с револьверным устройством) до плоскости предмета при сфокусированном микроскопе, является постоянной величиной и обеспечивает парфокальность комплекта аналогичных по высоте объективов разного увеличения, установленных в револьверном устройстве. Иными словами, если с помощью объектива одного увеличения получить резкое изображение объекта, то при переходе к последующим увеличениям изображение объекта остается резким в пределах глубины резкости объектива.

По конструктивно-технологическим признакам существует следующее разделение:

1. объективы, имеющие пружинящую оправу (начиная с числовой апертуры 0,50), и без нее;
2. объективы, имеющие ирисовую диафрагму внутри для изменения числовой апертуры (например, в объективах с увеличенной числовой апертурой, в объективах проходящего света для реализации метода темного поля, в поляризационных объективах отраженного света);
3. объективы с корректирующей (управляющей) оправой, которая обеспечивает движение оптических элементов внутри объектива (например, для корректировки качества изображения объектива при работе с различной толщиной покровного стекла или с различными иммерсионными жидкостями; а также для изменения увеличения при плавной — панкратической — смене увеличения) и без нее.

По обеспечению методов исследования и контрастирования объективы можно разделить следующим образом:

1. объективы, работающие с покровным и без покровного стекла;
2. объективы проходящего и отраженного света (безрефлексные); люминесцентные объективы (с минимумом собственной люминесценции); поляризационные объективы (без натяжения стекла в оптических элементах, т. е. не вносящие собственную деполяризацию); фазовые объективы (имеющие фазовый элемент — полупрозрачное кольцо внутри объектива); объективы ДИК (DIC), работающие по методу дифференциально-интерференционного контраста (поляризационные с призменным элементом); эпиобъективы (объективы отраженного света, предназначенные для обеспечения методов светлого и темного поля, имеют в конструкции специально рассчитанные осветительные эпи-зеркала);
3. иммерсионные и безыммерсионные объективы.

Иммерсия (от лат. immersio — погружение ) — жидкость, заполняющая пространство между объектом наблюдения и специальным иммерсионным объективом (конденсором и предметным стеклом). В основном применяются три типа иммерсионных жидкостей: масляная иммерсия (МИ/Oil), водная иммерсия (ВИ/W) и глицериновая иммерсия (ГИ/Glyc), причем последняя в основном применяется в ультрафиолетовой микроскопии.
Иммерсия применяется в тех случаях, когда требуется повысить разрешающую способность микроскопа или её применения требует технологический процесс микроскопирования. При этом происходит:

1. повышение видимости за счет увеличения разности показателя преломления среды и объекта;
2. увеличение глубины просматриваемого слоя, который зависит от показателя преломления среды.

Кроме того, иммерсионная жидкость может уменьшать количество рассеянного света за счет исчезновения бликов от объекта. При этом устраняются неизбежные потери света при его попадании в объектив.

Иммерсионные объективы. Качество изображения, параметры и оптическая конструкция иммерсионных объективов рассчитываются и выбираются с учетом толщины слоя иммерсии, которая рассматривается как дополнительная линза с соответствующим показателем преломления. Иммерсионная жидкость, расположенная между объектом и фронтальным компонентом объектива, увеличивает угол, под которым рассматривается объект (апертурный угол). Числовая апертура безыммерсионного (сухого) объектива не превышает 1,0 (разрешающая способность порядка 0,3 мкм для основной длины волны); иммерсионного — доходит до 1,40 в зависимости от показателя преломления иммерсии и технологических возможностей изготовления фронтальной линзы (разрешающая способность такого объектива порядка 0,12 мкм).
Иммерсионные объективы больших увеличений имеют короткое фокусное расстояние — 1,5-2,5 мм при свободном рабочем расстоянии 0,1-0,3 мм (расстояние от плоскости препарата до оправы фронтальной линзы объектива).

Маркировка объективов.

Данные о каждом объективе маркируются на его корпусе с указанием следующих параметров:

1. увеличение («х»-крат, раз): 8х, 40х, 90х;
2. числовая апертура: 0,20; 0,65, пример: 40/0,65 или 40х/0,65;
3. дополнительная буквенная маркировка, если объектив используется при различных методах исследования и контрастирования: фазовый — Ф (Рп2 — цифра соответствует маркировке на специальном конденсоре или вкладыше), поляризационный — П (Pol), люминесцентный — Л (L), фазово-люминесцентный — ФЛ (PhL), ЭПИ (Epi, HD) — эпиобъектив для работы в отраженном свете по методу темного поля, дифференциально-интерференционный контраст — ДИК (DIC), пример: 40х/0,65 Ф или Ph2 40x/0,65;
4. маркировка типа оптической коррекции: апохромат — АПО (АРО), планахромат — ПЛАН (PL, Plan), планапохромат — ПЛАН-АПО (Plan-Аро), улучшенный ахромат, полуплан — СХ — стигмахромат (Achrostigmat, CP-achromat, Achroplan), микрофлюар (полуплан-полуапохромат) — СФ или М-ФЛЮАР (MICROFLUAR, NEOFLUAR, NPL, FLUOTAR).

Окуляры

Оптические системы, предназначенные для построения микроскопического изображения на сетчатке глаза наблюдателя. В общем виде окуляры состоят из двух групп линз: глазной — ближайшей к глазу наблюдателя — и полевой — ближайшей к плоскости, в которой объектив строит изображение рассматриваемого объекта.

Окуляры классифицируются по тем же группам признаков, что и объективы:

1. окуляры компенсационного (К — компенсируют хроматическую разность увеличения объективов свыше 0,8%) и безкомпенсационного действия;
2. окуляры обычные и плоского поля;
3. окуляры широкоугольные (с окулярным числом — произведение увеличения окуляра на его линейное поле — более 180); сверхширокоугольные (с окулярным числом более 225);
4. окуляры с вынесенным зрачком для работы в очках и без;
5. окуляры для наблюдения, проекционные, фотоокуляры, гамалы;
6. окуляры с внутренней наводкой (с помощью подвижного элемента внутри окуляра происходит настройка на резкое изображение сетки или плоскость изображения микроскопа; а также плавное, панкратическое изменение увеличения окуляра) и без нее.

Осветительная система

Осветительная система является важной частью конструкции микроскопа и представляет собой систему линз, диафрагм и зеркал (последние применяются при необходимости), обеспечивающую равномерное освещение объекта и полное заполнение апертуры объектива.
Осветительная система микроскопа проходящего света состоит из двух частей — коллектора и конденсора.

Коллектор.
При встроенной осветительной системе проходящего света коллекторная часть расположена вблизи источника света в основании микроскопа и предназначена для увеличения размера светящегося тела. Для обеспечения настройки коллектор может быть выполнен подвижным и перемещаться вдоль оптической оси. Вблизи коллектора располагается полевая диафрагма микроскопа.

Конденсор.
Оптическая система конденсора предназначена для увеличения количества света, поступающего в микроскоп. Конденсор располагается между объектом (предметным столиком) и осветителем (источником света).
Чаще всего в учебных и простых микроскопах конденсор может быть выполнен несъемным и неподвижным. В остальных случаях конденсор является съемной частью и при настройке освещения имеет фокусировочное перемещение вдоль оптической оси и центрировочное перемещение, перпендикулярное оптической оси.
При конденсоре всегда находится осветительная апертурная ирисовая диафрагма.

Конденсор является одним из основных элементов, обеспечивающих работу микроскопа по различным методам освещения и контрастирования:

• косое освещение (диафрагмирование от края к центру и смещение осветительной апертурной диафрагмы относительно оптической оси микроскопа);
• темное поле (максимальное диафрагмирование от центра к краю осветительной апертуры);
• фазовый контраст (кольцевое освещение объекта, при этом изображение светового кольца вписывается в фазовое кольцо объектива).

Классификация конденсоров близка по группам признаков к объективам:

1. конденсоры по качеству изображения и типу оптической коррекции делятся на неахроматические, ахроматические, апланатические и ахроматические-апланатические;
2. конденсоры малой числовой апертуры (до 0,30), средней числовой апертуры (до 0,75), большой числовой апертуры (свыше 0,75);
3. конденсоры с обычным, большим и сверхбольшим рабочим расстоянием;
4. обычные и специальные конденсоры для различных методов исследования и контрастирования;
5. конструкция конденсора — единая, с откидным элементом (фронтальным компонентом или линзой большого поля), со свинчивающимся фронтальным элементом.

Конденсор Аббе — не исправленный по качеству изображения конденсор, состоящий из 2-х неахроматических линз: одной — двояковыпуклой, другой — плосковыпуклой, обращенной к объекту наблюдения (плоская сторона этой линзы направлена вверх). Апертура конденсора, А= 1,20. Имеет ирисовую диафрагму.

Апланатический конденсор — конденсор, состоящий из трех линз, расположенных следующим образом: верхняя линза — плосковыпуклая (плоская сторона направлена к объективу), далее следуют вогнуто-выпуклая и двояковыпуклая линзы. Исправлен в отношении сферической аберрации и комы. Апертура конденсора, А = 1.40. Имеет ирисовую диафрагму.

Ахроматический конденсор — конденсор, полностью исправленный в отношении хроматической и сферической аберрации.

Конденсор темного поля — конденсор, предназначенный для получения эффекта темного поля. Может быть специальным или переделан из обычного светлопольного конденсора путем установки в плоскости ирисовой диафрагмы конденсора непрозрачного диска определенного размера.

Маркировка конденсора.
На фронтальной части конденсора наносится маркировка числовой апертуры (осветительной).

3. Электрическая часть микроскопа

В современных микроскопах, вместо зеркал, используются различные источники освещения, питаемые от электрической сети. Это могут быть как обычные лампы накаливания, так и галогенные, и ксеноновые, и ртутные лампы. Также все большую популярность набирают светодиодные осветители. Они обладают значительными преимуществами перед обычными лампами, как например долговечность, меньшее энергопотребление и др. Для питания источника освещения используются различные блоки питания, блоки розжига и другие устройства, преобразующие ток из электрической сети в подходящий для питания того или иного источника освещения. Также это могут быть и аккумуляторные батареи, что позволяет использовать микроскопы в полевых условиях при отсутствии точки подключения.